王皓田 李娜 陳文芳

[摘要] 目的 探討淫羊藿苷（ICA）對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用。方法將細(xì)胞種于6孔板，分為對照組、LPS組和ICA給藥組。對照組先用1 μL二甲基亞礬（DMSO）處理細(xì)胞1 h，再加入1 μL生理鹽水;LPS組先用1 μL DMSO預(yù)處理細(xì)胞1 h，再加入LPS （終濃度1 mg/L）處理細(xì)胞6 h;ICA給藥組先用不同濃度的ICA （0.1、1.0、10.0、20.0 μmol/L）預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后與LPS共同孵育細(xì)胞6 h。采用熒光定量PCR（RT-PCR）法分別檢測各組細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）mRNA的表達。應(yīng)用RT-PCR法檢測ICA給藥組（10.0 μmol/L）腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（IL-1β） mRNA的表達，并與對照組、LPS組檢測結(jié)果比較。結(jié)果 與對照組相比較，LPS組的GFAP mRNA表達明顯升高（F=10.63，q=9.775，P<0.01）;1.0、10.0、20.0 μmol/L的ICA均能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)的GFAP mRNA的表達（q=4.496～6.111，P<0.05），以10.0 μmol/L ICA的抑制效果最明顯（q=6.111，P<0.01）。與對照組相比較，LPS組的TNF-α和IL-1β mRNA表達明顯升高（F=243.50、378.60，q=30.040、36.000，P<0.01），10.0 μmol/L ICA組TNF-α和IL-1β mRNA表達較LPS組顯著降低（q=7.689、5.199，P<0.05）。結(jié)論 ICA能夠抑制LPS誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng)。

[關(guān)鍵詞] 淫羊藿甙;脂多糖;星形細(xì)胞;腫瘤壞死因子α;白細(xì)胞介素1β;神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì)

[中圖分類號] Q421 ?[文獻標(biāo)志碼] A ?[文章編號] 2096-5532（2020）02-0181-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.094 [開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200519.1433.006.html;2020-05-19 17：25

[ABSTRACT] Objective To investigate the inhibitory effect of icariin （ICA） against lipopolysaccharide （LPS）-induced inflammatory response in primary astrocytes. ?Methods Cells were seeded in a 6-well plate and divided into control group， LPS group， and ICA groups. The control group was treated with 1 μL DMSO for 1 h and then 1 μL normal saline for 6 h. The LPS group was treated with 1 μL DMSO for 1 h and then LPS （final concentration， 1 mg/L） for 6 h. The ICA groups received 1 h pretreatment with ICA at 0.1， 1.0， 10.0， and 20.0 μmol/L， respectively， followed by co-incubation with LPS for 6 h. RT-PCR was used to determine the mRNA expression of glial fibrillary acidic protein （GFAP） in all the groups， and to determine the mRNA expression of TNF-α and IL-1β in the control group， the LPS group， and the 10.0 μmol/L ICA group. ?Results Compared with the control group， the LPS group showed a significantly higher mRNA expression level of GFAP （F=10.63，q=9.775，P<0.01）; LPS-induced mRNA expression of GFAP was significantly inhibited by ICA at 1.0，10.0， and 20.0 μmol/L （q=4.496-6.111，P<0.05）， with the strongest inhibitory effect at 10 μmol/L （q=6.111，P<0.01）. The mRNA expression levels of TNF-α and IL-1β in the LPS group were significantly higher than those in the control group （F=243.50，378.60;q=30.040，36.000;P<0.01）， and also significantly higher than those in the 10.0 μmol/L ICA group （q=7.689，5.199;P<0.05）. ?Conclusion ICA inhibits LPS-induced activation of primary astrocytes and inflammatory response.

[KEY WORDS] icariin; lipopolysaccharides; astrocytes; tumor necrosis factor-alpha; interleukin-1beta; glial fibrillary acidic protein

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)數(shù)量最多、分布最為廣泛的一類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[1]，在修復(fù)再生、免疫應(yīng)答、能量代謝調(diào)節(jié)、神經(jīng)遞質(zhì)代謝、營養(yǎng)、突觸可塑性以及血-腦脊液屏障完整性的維持等多個方面發(fā)揮重要作用[2-5]。許多研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)在阿爾茨海默癥、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的病理過程有重要作用[6-7]。因此，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化是神經(jīng)退行性疾病的一種有效治療策略。脂多糖（LPS）可通過與星形膠質(zhì)細(xì)胞的Toll樣受體4（TLR4）結(jié)合，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，引起膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）表達的增加并釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（IL-1β）等炎性因子，引發(fā)神經(jīng)炎癥損傷神經(jīng)元[8-10]。淫羊藿苷（ICA）是淫羊藿總黃酮中的一種重要生物活性成分，具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、補腎壯陽、誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化、抗衰老和抗腫瘤等功效[11-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，ICA通過抑制TNF-α、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的mRNA表達，抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺部炎癥反應(yīng)[14]。那么ICA是否能通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)來保護神經(jīng)元從而阻止神經(jīng)退行性疾病的進展，目前尚未見報道。本研究采用分子生物學(xué)技術(shù)，研究ICA對LPS誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、TNF-α和IL-1β mRNA 表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及其來源

ICA購自上海同田生物技術(shù)有限公司，用二甲基亞砜（DMSO）溶液稀釋為所需實驗濃度。LPS購自Sigma公司。DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自BI公司;青霉素/鏈霉素儲存液購于新華制藥廠，開啟前分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆?。新?4 h的SD大鼠購于青島大任富城畜牧有限公司。TRIzol購自Invitrogen 公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR green購于Takara公司;引物由Takara公司設(shè)計并合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

在超凈工作臺取新生24 h左右的SD大鼠（SPF級）大腦，然后分離出中腦，用滅菌后的PBS清洗3次后，輕輕剝離腦膜和血管。將腦組織剪碎，吹打使細(xì)胞分散，收集細(xì)胞懸液至大離心管中，以1 000 r/min 離心5 min。棄上清，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基（含胎牛血清、青霉素/鏈霉素混合液），將細(xì)胞吹打重懸，然后接種于鋪有poly-D的150 cm2培養(yǎng)瓶中，放置在含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d更換1次培養(yǎng)液。待細(xì)胞長滿后，放到恒溫?fù)u床以37 ℃、210 r/min震蕩16～18 h后，棄掉上清，用DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3次，加入2.5 g/L的胰酶消化1～3 min，用含血清的完全培養(yǎng)基終止消化，輕柔吹打?qū)①N于培養(yǎng)瓶上的細(xì)胞吹下，收集細(xì)胞。然后，以1 000 r/min離心5 min后，將星形膠質(zhì)細(xì)胞接種到6孔板中。當(dāng)6孔板內(nèi)的細(xì)胞融合達到80%左右時，將細(xì)胞分為對照組（A組）、LPS組（B組）、0.1 μmol/L ICA+LPS組（C組）、1.0 μmol/L ICA+LPS（D組）、10.0 μmol/L ICA+LPS（E組）、20.0 μmol/L ICA +LPS（F組）。A組給予1 μL的DMSO處理1 h，再加入1 μL生理鹽水;B組用1 μL DMSO預(yù)處理1 h，再加入LPS（終濃度1 mg/L）共同作用6 h;C組、D組、E組、F組分別用0.1、1.0、10.0和20.0 μmol/L ICA 1 μL預(yù)處理1 h，再加入LPS（終濃度1 mg/L）共同作用6 h。

1.3 熒光定量PCR（RT-PCR）檢測GFAP、TNF-α和IL-1β的mRNA表達

按照TRIzol reagent說明書提取總RNA，然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的要求將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA放入實時熒光定量PCR儀中，采用SYBR green染料法分別檢測相關(guān)基因的表達。PCR反應(yīng)體系為20.0 μL，內(nèi)含：SYBR green染料10.0 μL，RNA free water 8.2 μL，上下游引物各0.4 μL以及cDNA 1.0 μL。經(jīng)過40個循環(huán)完成擴增，并在程序后添加溶解曲線，以檢測擴增品質(zhì)。以不添加cDNA的擴增溶液為空白對照組。使用2-ΔΔCT法計算目的基因（GFAP、TNF-α、IL-1β）和內(nèi)參基因GAPDH的相對表達量，同時檢查溶解曲線是否為單峰、引物擴增效率及擴增的相關(guān)系數(shù)等情況。RT-PCR引物及其序列見表1。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用Graph Pad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料結(jié)果以±s形式表示，數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），并繼以Tukey法進行兩兩比較。

2 結(jié) ?果

2.1 各組GFAP mRNA表達比較

與對照組比較，LPS組的GFAP mRNA表達明顯升高，差異有顯著性（F=10.63，q=9.775，P<0.01）;1.0、10.0、20.0 μmol/L的ICA均可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP mRNA的表達（q=4.496～6.111，P<0.05），其中10.0 μmol/L ICA的抑制作用最明顯（q=6.111，P<0.01）。因此，后續(xù)實驗我們將10.0 μmol/L的ICA作為最佳用藥濃度。見表2。

2.2 各組TNF-α和IL-1β mRNA表達比較

與對照組相比較，LPS組原代星形膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-1β的mRNA表達均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=243.50、378.60，q=30.040、36.000，P<0.01）;與LPS組相比，10 μmol/L ICA能夠明顯抑制原代星形膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-1β mRNA的表達，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（q=7.689、5.199，P<0.05）。見表3。

3 討 ?論

體內(nèi)和體外研究均表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程中起著至關(guān)重要的作用。與小膠質(zhì)細(xì)胞相似，星形膠質(zhì)細(xì)胞受到炎性刺激過度激活，會產(chǎn)生大量的炎性因子如IL-1β和TNF-α等，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷[15-16]。已有研究顯示，在不同的帕金森病動物模型中均發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生;且在嚙齒類動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)實驗性損傷模型中觀察到，星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP表達增加[17]，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞可能參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病與進展[18-19]。

ICA是從小檗科植物淫羊藿中提取的一種黃酮類化合物，具有骨保護、促生殖、抗腫瘤、改善心腦血管功能、神經(jīng)保護、抗炎等多種功效[20-24]。本課題組前期研究證明，在離體細(xì)胞和整體動物水平，ICA均能夠?qū)股窠?jīng)毒素對多巴胺能神經(jīng)元的損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[25]。本研究通過LPS誘導(dǎo)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)以制備神經(jīng)炎癥模型，探討ICA的抗炎作用。GFAP是主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的一種蛋白質(zhì)，是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物[26-27]。在腦損傷和中樞系統(tǒng)發(fā)生病變的過程中，星形膠質(zhì)細(xì)胞會被大量激活，GFAP的表達上調(diào)[28-30]。本實驗結(jié)果顯示，LPS能夠使原代星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達明顯上調(diào)，應(yīng)用不同濃度的ICA預(yù)處理后，GFAP mRNA的表達被不同程度地抑制，提示ICA能夠抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化，其中10 μmol/L的ICA作用效果最明顯，因此后續(xù)實驗我們將10 μmol/L作為ICA的最佳用藥濃度。此外，LPS能夠明顯誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子TNF-α和IL-1β mRNA的表達，而應(yīng)用濃度為10 μmol/L的ICA預(yù)處理后能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)的上述兩種炎性因子的基因表達，因而有效地減少了星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，將有利于減低炎性因子對神經(jīng)元的損傷。

綜上所述，ICA能夠抑制LPS誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng)，為今后應(yīng)用ICA對抗神經(jīng)炎癥提供了實驗依據(jù)。

[參考文獻]

[1] JI R R， DONNELLY C R， NEDERGAARD M. Astrocytes in chronic pain and itch[J]. Nature Reviews Neuroscience， 2019，20（11）：667-685.

[2] SPAMPINATO S F， BORTOLOTTO V， CANONICO P L， et al. Astrocyte-derived paracrine signals： relevance for neurogenic niche regulation and blood-brain barrier integrity[J]. Frontiers in Pharmacology， 2019，10：1346.

[3] PAJARILLO E， RIZOR A， LEE J， et al. The role of astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST in neurological disorders： Potential targets for neurotherapeutics[J]. Neuropharmacology， 2019，161：107559.

[4] FALKOWSKA A， GUTOWSKA I， GOSCHORSKA M， et al. Energy metabolism of the brain， including the cooperation between astrocytes and neurons， especially in the context of glycogen metabolism[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2015，16：25959-25981.

[5] BURDA J E， BERNSTEIN A M， SOFRONIEW M V. Astrocyte roles in traumatic brain injury[J]. Experimental Neurology， 2016，275（3， SI）：305-315.

[6] JAYARAJ R L， BEIRAM R， AZIMULLAH S， et al. Lycopo-dium attenuates loss of dopaminergic neurons by suppressing ? oxidative stress and neuroinflammation in a rat model of Parkinsons disease[J]. Molecules， 2019，24：2182.

[7] ACOSTA C， ANDERSON H D， ANDERSON C M. Astrocyte dysfunction in alzheimer disease[J]. Journal of Neuroscience Research， 2017，95（12）：2430-2447.

[8] LIU Tong， GAO Yongjing， JI Rurong. Emerging role of Toll-like receptors in the control of pain and itch[J]. Neuroscience Bulletin， 2012，28（2）：131-144.

[9] GORINA R， FONT-NIEVES M， MARQUEZ-KISINOUSKY L， et al. Astrocyte TLR4 activation induces a proinflammatory environment through the interplay between MyD88-dependent NF kappa B signaling， MAPK， and Jak1/Stat1 pathways[J]. Glia， 2011，59（2）：242-255.

[10] BOWMAN C C， RASLEY A， TRANGUCH S L， et al. Cultured astrocytes Express toll-like receptors for bacterial pro-ducts[J]. Glia， 2003，43（3）：281-291.

[11] ZHANG Lei， ZHANG Xuan， LI Kuifeng， et al. Icariin promotes extracellular matrix synthesis and gene expression of chondrocytes in vitro[J]. Phytotherapy Research， 2012，26（9）：1385-1392.

[12] HUANG Xin， ZHU Danyan， LOU Yijia. A novel anticancer agent， icaritin， induced cell growth inhibition， G1 arrest and mitochondrial transmembrane potential drop in human prostate carcinoma PC-3 cells[J]. European Journal of Pharmacology， 2007，564（1/3）：26-36.

[13] CHUNG B H， KIM J D， KIM C K， et al. Icariin stimulates angiogenesis by activating the MEK/ERK-and PI3K/Akt/eNOS-dependent signal pathways in human endothelial cells[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2008，376（2）：404-408.

[14] XU Changqing， LIU Baojun， WU Jinfeng， et al. Icariin atte-nuates LPS-induced acute inflammatory responses： involvement of PI3K/Akt and NF-kappa B signaling pathway[J]. European Journal of Pharmacology， 2010，642（1/3）：146-153.

[15] TANAKA T， KAI S， MATSUYAMA T， et al. General anesthetics inhibit LPS-induced IL-1beta expression in glial cells[J]. PLoS One， 2013，8（12）： e82930.

[16] SAIJO K， WINNER B， CARSON C T， et al. A Nurr1/CoREST pathway in microglia and astrocytes protects dopaminergic neurons from inflammation-induced death[J]. Cell， 2009，137（1）：47-59.

[17] ZHANG Fangxue， XU Renshi. Juglanin ameliorates LPS-induced neuroinflammation in animal models of Parkinsons di-sease and cell culture via inactivating TLR4/NF-κB pathway[J]. Biomedicine& Pharmacotherapy， 2018，97：1011-1019.

[18] TRONCOSO-ESCUDERO P， PARRA A， NASSIF M， et al. Outside in： unraveling the role of neuroinflammation in the progression of Parkinsons disease[J]. Frontiers in Neurology， 2018，9：860.

[19] FELLNER L， IRSCHICK R， SCHANDA K， et al. Toll-like receptor 4 is required for alpha-synuclein dependent activation of microglia and astroglia[J]. Glia， 2013，61：349-360.

[20] 路宇仁，陳昳冰，崔元璐，等. 淫羊藿苷藥理作用研究進展[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志， 2018，24（17）：209-220.

[21] ZHOU Heng， YUAN Yuan， LIU Yuan， et al. Icariin atte-nuates angiotensin Ⅱ-induced hypertrophy and apoptosis in H9c2 cardiomyocytes by inhibiting reactive oxygen species-dependent JNK and p38 pathways[J]. Experimental and Therapeutic Medicine， 2014，7：1116-1122.

[22] ZHENG Yaxin， ZHU Guofu， HE Jingyi， et al. Icariin targets Nrf2 signaling to inhibit microglia-mediated neuroinflammation[J]. International Immunopharmacology， 2019，73：304-311.

[23] ZHANG Shuncong， FENG Pengbo， MO Guoye， et al. Icariin influences adipogenic differentiation of stem cells affected by osteoblast-osteoclast co-culture and clinical research adipogenic[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 2017，88：436-442.

[24] 陳茹，蘇瑩，柳江. 淫羊藿苷通過Wnt/β-catenin信號通路對卵巢癌細(xì)胞CAOV3增殖的影響[J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志， 2019，48（3）：44-49.

[25] CHEN Wenfang， WU Lin， DU Zhongrui， et al. Neuroprotective properties of icariin in MPTP-induced mouse model of Parkinsons disease： involvement of PI3K/Akt and MEK/ERK signaling pathways[J]. Phytomedicine， 2017，25：93-99.

[26] 戴淑馨，王宇，林麗芳，等. PR-957對A1反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞形成的影響[J]. 中國當(dāng)代兒科雜志， 2019，21（11）：1110-1115.

[27] 蘇曉梅，張丹參. 星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)退行性疾病的相關(guān)性[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志， 2019，33（10）：868-869.

[28] ULLAH F， ASGAROV R， VENIGALLA M， et al. Effects of a solid lipid curcumin particle formulation on chronic activation of microglia and astroglia in the GFAP-IL6 mouse model[J]. Scientific Reports， 2020，10（1）：2365.

[29] PEKNY M， WILHELMSSON U， TATLISUMAK T， et al. Astrocyte activation and reactive gliosis-a new target in stroke[J]？ Neuroscience Letters， 2019，689：45-55.

[30] KOSUGE Y， KANEKO E， NANGO H， et al. Bidens pilosa extract administered after symptom onset attenuates glial activation， improves motor performance， and prolongs survival in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity， 2020，2020：1020673.

（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）