孫曉敏 張萌 遲宜嘉 郭林靄 石海群 周宇

[摘要] 目的 研究反復(fù)禁錮應(yīng)激對(duì)小鼠焦慮相關(guān)腦區(qū)c-Fos表達(dá)的影響。方法 將2月齡雄性C57BL6/J小鼠12只隨機(jī)均分為對(duì)照組、禁錮后90 min組和禁錮后7 d組，對(duì)后兩組小鼠進(jìn)行反復(fù)禁錮應(yīng)激。利用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3組小鼠的焦慮水平，采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)3組小鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)（mPFC）、下丘腦（HY）、腹側(cè)海馬（vHPC）、基底外側(cè)杏仁核（BLA）等4個(gè)焦慮相關(guān)腦區(qū)c-Fos的表達(dá)情況。結(jié)果 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)表明，反復(fù)禁錮應(yīng)激后7 d，小鼠表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為（t=3.364、6.386，P<0.05），而禁錮應(yīng)激后90 min的小鼠焦慮樣行為不明顯（P>0.05）。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，禁錮后90 min組小鼠各腦區(qū)c-Fos表達(dá)均明顯增加（F=13.4～645.0，q=5.1～31.6，P<0.01），而禁錮后7 d組小鼠只有HY和BLA腦區(qū)c-Fos表達(dá)仍然明顯增加（q=3.0、3.0，P<0.05）。結(jié)論 反復(fù)禁錮應(yīng)激導(dǎo)致HY和BLA腦區(qū)c-Fos表達(dá)持續(xù)增加，這可能與小鼠的焦慮樣行為密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 焦慮;約束，身體的;大腦;基因，即早;小鼠

[中圖分類號(hào)] R338.2 ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A ?[文章編號(hào)] 2096-5532（2020）02-0177-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.067 [開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200417.1001.018.html;2020-04-17 17：12

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of repeated restraint stress on the expression of c-Fos in anxiety-related brain regions in mice. ?Methods A total of 12 male C57BL6/J mice， aged 2 months， were randomly divided into control group， 90 min post-stress group， and 7 d post-stress group， and the mice in the latter two groups were given repeated restraint stress. The elevated plus maze test was used to evaluate the level of anxiety， and immunofluorescence assay was used to measure the expression of c-Fos in the four anxiety-related brain regions of the medial prefrontal cortex （mPFC）， the hypothalamus （HY）， the ventral hippocampus （vHPC）， and the basolateral amygdala （BLA）. ?Results The elevated plus maze test showed that the mice displayed significant anxiety-like behavior on day 7 after repeated restraint stress （t=3.364，6.386，P<0.05）， while the mice in the 90 min post-stress group did not develop significant anxiety-like behavior （P>0.05）. The results of immunofluorescence assay showed that compared with the control group， the 90 min post-stress group had a significant increase in the expression of c-Fos in each brain region （F=13.4-645.0，q=5.1-31.6，P<0.01）， while the 7 d post-stress group had a significant increase in the expression of c-Fos in the HY and the BLA （q=3.0，3.0，P<0.05）. ?Conclusion Repeated restraint stress leads to a continuous increase in c-Fos expression in the HY and the BLA， which may closely associated with anxiety-like behavior in mice.

[KEY WORDS] anxiety; restraint， physical; cerebrum; genes， immediate-early; mice

適度的焦慮對(duì)動(dòng)物與人類的生存具有重要意義，但過度的焦慮則是一種情緒障礙。焦慮癥等情感障礙性精神疾病的病因至今仍不清楚，但普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為遺傳和環(huán)境等因素相互作用在焦慮抑郁等情感障礙性精神疾病的發(fā)病中占有至關(guān)重要的地位。應(yīng)激刺激是導(dǎo)致焦慮的重要誘發(fā)因素。研究表明，內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)（mPFC）、腹側(cè)海馬（vHPC）、基底外側(cè)杏仁核（BLA）、下丘腦（HY）等腦區(qū)在焦慮相關(guān)行為調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，是重要的焦慮神經(jīng)環(huán)路節(jié)點(diǎn)[1-4]。在應(yīng)激導(dǎo)致焦慮的研究中，反復(fù)禁錮應(yīng)激常被用于急性和慢性焦慮造模，能顯著引起小鼠的焦慮樣行為[5-11]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示，在4 d反復(fù)禁錮應(yīng)激后的7～12 d，小鼠的焦慮樣行為表型明顯。神經(jīng)元受到外界刺激后會(huì)迅速表達(dá)c-Fos，c-Fos蛋白的表達(dá)通常被認(rèn)為是神經(jīng)元活動(dòng)的重要標(biāo)志[12]。張頎等[13]以c-fos為探針研究顯示，強(qiáng)迫游泳后C57BL/6小鼠的mPFC、杏仁核、伏隔核被激活。既往研究觀察的多是應(yīng)激后c-Fos的急性表達(dá)，而對(duì)于焦慮狀態(tài)下c-Fos在不同腦區(qū)的表達(dá)鮮有報(bào)道。因此，本研究擬觀察4 d反復(fù)禁錮應(yīng)激后90 min及7 d時(shí)小鼠mPFC、HY、vHPC、BLA腦區(qū)c-Fos的表達(dá)情況，旨在探討反復(fù)禁錮應(yīng)激對(duì)小鼠焦慮相關(guān)腦區(qū)c-Fos表達(dá)的影響，以及c-Fos表達(dá)與焦慮樣行為之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為2月齡雄性C57BL6/J小鼠12只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)條件為溫度（21±2）℃、濕度（50±10）%、12 h/12 h晝夜等長(zhǎng)循環(huán)光照，小鼠可自由飲水、進(jìn)食。小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境至少1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。c-Fos一抗為c-Fos（9F6）Rabbit mAb#2250，購自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;c-Fos二抗為Alexa-568 goat anti-rabbit，購自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 動(dòng)物分組及處理

實(shí)驗(yàn)前將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（A組）、禁錮后90 min組（B組）和禁錮后7 d組（C組），每組4只。對(duì)3組小鼠進(jìn)行高架十字迷宮行為學(xué)測(cè)試，檢測(cè)其基礎(chǔ)焦慮水平。B組和C組小鼠進(jìn)行連續(xù)4 d的反復(fù)禁錮應(yīng)激，分別于4 d禁錮后90 min和禁錮后7 d再次進(jìn)行高架十字迷宮測(cè)試，然后立即進(jìn)行灌注取腦。A組小鼠不做任何處理，直接從飼養(yǎng)籠中取出進(jìn)行灌注取腦。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中3組小鼠均正常飼養(yǎng)，沒有出現(xiàn)小鼠缺失的情況。

1.3 反復(fù)禁錮應(yīng)激

將小鼠用異氟烷輕度麻醉后放置于禁錮器中1 h，禁錮時(shí)間為每天下午14：00—15：00，連續(xù)禁錮4 d。禁錮器是兩端均可拆開的圓筒狀物，材質(zhì)為有機(jī)玻璃，透明且通風(fēng)透氣良好。被放于禁錮器中的小鼠無法移動(dòng)，不可掉頭。

1.4 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)裝置由十字迷宮、視頻采集系統(tǒng)及分析系統(tǒng)3部分組成。高架十字迷宮是由兩個(gè)開放臂、兩個(gè)閉合臂及一個(gè)中心區(qū)組成。測(cè)試時(shí)，將小鼠從中心區(qū)釋放入迷宮，讓小鼠在高架十字迷宮中自由活動(dòng)10 min。通過Noduls自動(dòng)分析系統(tǒng)記錄小鼠在開放臂、閉合臂、中心區(qū)各個(gè)區(qū)域的探索時(shí)間以及進(jìn)出開放臂和閉合臂的次數(shù)。

1.5 c-Fos免疫熒光染色和免疫陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)

用生理鹽水和新配制的40 g/L多聚甲醛對(duì)小鼠進(jìn)行心臟灌注，取腦放入4 ℃多聚甲醛中固定6 h，然后轉(zhuǎn)入300 g/L蔗糖溶液中至沉淀。用恒冷箱冷凍切片機(jī)切片（厚度40 μm），放入 0.01 mol/L的PBS溶液中。小鼠的腦切片用體積分?jǐn)?shù)0.04的山羊血清封閉液封閉1 h，加c-Fos一抗（1∶3 200）在4 ℃搖床中孵育 72 h，孵育后以PBS溶液沖洗3次，每次10 min。然后加熒光二抗（1∶500）孵育2 h，以PBS清洗3次，每次15 min。洗完后用封片劑ProLong Gold Antifade Reagent（美國(guó)Invitrogen公司）封片。根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜（第2版）明確區(qū)分4個(gè)目的腦區(qū)，用OLYMPUS全自動(dòng)虛擬切片掃描系統(tǒng)（VS120）對(duì)目的腦區(qū)的熒光圖像進(jìn)行掃描拍攝（20倍干物鏡）。使用Image J軟件的圖像閾值測(cè)量工具對(duì)目的腦區(qū)感興趣區(qū)域（ROI）的c-Fos免疫陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。每組任選3只小鼠的腦切片行免疫熒光染色，每只小鼠選取4個(gè)有代表性的目的腦區(qū)染色切片進(jìn)行圖像采集，每張圖像上選取3個(gè)不同的ROI進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。選取ROI的大小為1 mm2。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s形式表示，應(yīng)用Graph Pad Prism 6.0軟件對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。B、C組小鼠禁錮前后在高架十字迷宮開放臂停留時(shí)間及進(jìn)入開放臂次數(shù)的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn);3組小鼠各腦區(qū)c-Fos免疫陽性細(xì)胞數(shù)的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），并繼以Dunnett法比較B、C組與A組的差異，用Tukey法比較B、C組的差異。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) ?果

2.1 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

B組小鼠禁錮前后在開放臂的停留時(shí)間和進(jìn)入開放臂的次數(shù)差異均無顯著意義（P>0.05）;C組小鼠禁錮后在開放臂的停留時(shí)間較禁錮前明顯縮短，進(jìn)入開放臂的次數(shù)較禁錮前明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.364、6.386，P<0.05）。見表1。

2.2 各組小鼠各腦區(qū)c-Fos免疫陽性細(xì)胞數(shù)比較

B組各腦區(qū)c-Fos免疫陽性細(xì)胞數(shù)較A組明顯增加（F=13.4～645.0，q=5.1～31.6，P<0.01）;C組HY和BLA腦區(qū)c-Fos免疫陽性細(xì)胞數(shù)亦較A組明顯增加（q=3.0、3.0，P<0.05），但mPFC和vHPC腦區(qū)c-Fos免疫陽性細(xì)胞數(shù)與A組相比差異無顯著性（P>0.05）;B組mPFC、BLA及vHPC腦區(qū)c-Fos免疫陽性細(xì)胞數(shù)與C組比較明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=13.8～43.3，P<0.01），但HY腦區(qū)c-Fos免疫陽性細(xì)胞數(shù)的增加并不明顯（P>0.05）。見表2。

3 討 ?論

常用的動(dòng)物焦慮抑郁模型主要包括應(yīng)激模型、藥理學(xué)模型、分養(yǎng)模型及腦組織損傷模型等。作為一種經(jīng)典的單一性應(yīng)激源焦慮模型，反復(fù)禁錮應(yīng)激可明顯誘發(fā)小鼠的焦慮表型。雖然不同的研究中，每天應(yīng)激時(shí)長(zhǎng)及應(yīng)激持續(xù)天數(shù)各不相同，但小鼠焦慮表型明顯的這段時(shí)間通常被認(rèn)為是焦慮態(tài)時(shí)間窗[14-16]。本研究應(yīng)用的是連續(xù)4 d反復(fù)禁錮亞急性應(yīng)激模型。我們的前期研究顯示，在禁錮后的7～12 d，小鼠的焦慮表型明顯，即這段時(shí)間為小鼠的焦慮表型時(shí)間窗，而4 d禁錮剛結(jié)束時(shí)，小鼠仍處于應(yīng)激狀態(tài)，其焦慮表型并不明顯。本研究借助高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)，對(duì)各組小鼠的焦慮水平進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，反復(fù)禁錮后7 d，小鼠表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為，即在開放臂的停留時(shí)間明顯縮短，進(jìn)入開放臂的次數(shù)也明顯減少;而反復(fù)禁錮后90 min小鼠在開放臂的停留時(shí)間及進(jìn)入開放臂的次數(shù)僅有縮短或減少的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比差異無顯著性。

c-Fos蛋白是即刻早期基因c-fos轉(zhuǎn)錄翻譯的產(chǎn)物，是一種核內(nèi)磷酸化蛋白?；A(chǔ)狀態(tài)下，c-Fos蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)水平非常低甚至無表達(dá)，而在各種應(yīng)激刺激后，c-Fos蛋白的表達(dá)能夠被快速誘導(dǎo)。在應(yīng)激后的1～2 h，c-Fos蛋白的表達(dá)達(dá)到高峰，然后逐漸衰減[17]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)c-Fos蛋白的表達(dá)依賴于應(yīng)激源的內(nèi)在特性、強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。由于c-Fos蛋白的表達(dá)能在很大程度上反映刺激誘導(dǎo)的神經(jīng)元活動(dòng)，故常被作為神經(jīng)元激活的標(biāo)志物[18]。本研究應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)了各組小鼠不同腦區(qū)c-Fos的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，反復(fù)禁錮后90 min，小鼠mPFC、HY、BLA及vHPC這4個(gè)焦慮相關(guān)腦區(qū)c-Fos的表達(dá)水平與對(duì)照組相比均明顯增加，而反復(fù)禁錮后7 d小鼠僅HY和BLA腦區(qū)c-Fos的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，mPFC和vHPC腦區(qū)c-Fos表達(dá)雖有增加的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與相關(guān)文獻(xiàn)描述的c-Fos蛋白的表達(dá)變化情況一致[17]。值得注意的是，本研究還顯示，反復(fù)禁錮后7 d小鼠的焦慮樣表型明顯，同時(shí)c-Fos蛋白在HY和BLA腦區(qū)仍有較高的表達(dá)，提示這兩個(gè)腦區(qū)更有可能參與反復(fù)禁錮應(yīng)激后焦慮情緒的調(diào)節(jié)，從而與小鼠的焦慮樣行為密切相關(guān)。

以往的相關(guān)研究多采用急性應(yīng)激刺激，包括電擊、空瓶刺激、強(qiáng)迫游泳、寒冷、次聲、急性社交挫敗等[19-24]。急性應(yīng)激刺激誘發(fā)的c-Fos表達(dá)部位涉及額葉皮質(zhì)、扣帶皮質(zhì)、中央杏仁核、前連合核、下丘腦背內(nèi)側(cè)核彌散部、下丘腦室旁核、室周核、弓狀核、孤束核、丘腦外側(cè)備核、伏隔核、終紋床核等。慢性應(yīng)激后，c-Fos的表達(dá)部位主要涉及下丘腦室旁核、室周核、弓狀核、vHPC、背側(cè)海馬、mPFC、杏仁核、前扣帶皮質(zhì)、紋狀體、伏隔核等[22，25-28]。本研究應(yīng)用的是4 d反復(fù)禁錮亞急性應(yīng)激方式，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4 d反復(fù)禁錮應(yīng)激誘導(dǎo)的c-Fos在目的腦區(qū)均有表達(dá)，提示這種持續(xù)時(shí)間在2周以內(nèi)的亞急性應(yīng)激刺激誘導(dǎo)的c-Fos表達(dá)腦區(qū)分布更接近于以往報(bào)道的慢性應(yīng)激刺激。另外，本研究在高架十字迷宮測(cè)試結(jié)束后立即進(jìn)行灌注取腦，因此十字迷宮測(cè)試本身不會(huì)引起c-Fos蛋白的表達(dá)。

綜上所述，4 d反復(fù)禁錮應(yīng)激可誘導(dǎo)小鼠HY和BLA等焦慮相關(guān)腦區(qū)c-Fos表達(dá)的持續(xù)增加，并與小鼠的焦慮樣行為表型密切相關(guān)，提示這些腦區(qū)可能參與了反復(fù)禁錮應(yīng)激后焦慮情緒的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)深入研究上述核團(tuán)參與焦慮相關(guān)行為調(diào)控的突觸和神經(jīng)環(huán)路機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等應(yīng)激障礙性精神疾病的治療提供了理論基礎(chǔ)。

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（本文編輯 馬偉平）