李宇　劉翠君　艾倫強(qiáng)　張宇　盧新鵬　何美軍　冉亞蘭

摘要：從湖北省利川市齊岳山（海拔1 500～1 600 m）采集藤茶（Ampelopsis grossedentata）樣品，采用60%乙醇超聲提取總黃酮，利用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)雙波長(zhǎng)（λ=208.4 nm，λ=293.2 nm）檢測(cè)藤茶幼嫩莖尖總黃酮，平均含量高達(dá)453.67±11.26 mg/g;利用硅膠柱色譜及半制備高效液相分離到3個(gè)化合物，利用LC-HR-ESIMS、1D和2D NMR波譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，鑒定其結(jié)構(gòu)分別為二氫楊梅素（1）、楊梅素（2）和花旗松素（3）;通過(guò)高效液相（HPLC）檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，利川市藤茶樣品中二氫楊梅素、楊梅素和花旗松素的含量為別186.31±10.43、13.83±1.32、14.76±2.26 mg/g。

關(guān)鍵詞：藤茶（Ampelopsis grossedentata）;總黃酮;二氫楊梅素;楊梅素;花旗松素;利川市

中圖分類(lèi)號(hào)：S571.1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）04-0098-04

Abstract： The total flavonoids were extracted by 60% ethanol-ultrasound from the samples of Ampelopsis grossedentata collected from Qiyueshan mountain （1 500～1 600 m），Lichuan city， Hubei province. The total flavonoids in the young tips of Ampelopsis grossedentata was up to 453.67±11.26 mg/g detected by ultraviolet-visible spectrophotometer at the double-wavelength （λ=208.4 nm，λ=293.2 nm）. Three compounds were purified from the organic extract using LC-HR-ESIMS，1D and 2D NMR spectral data analysis. Their structures were identified to be dihydromyricetin（1）， myricetin（2），and taxifolin（3）. The contents of dihydromyricetin， myricetin and taxifolin were 186.31±10.43， 13.83±1.32 and 14.76±2.26 mg/g respectively detected by HPLC.

Key words： Ampelopsis grossedentata; total flavonoids; dihydromyricetin; myricetin;taxifolin; Lichuan city

黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)廣泛存在于植物體內(nèi)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其母核結(jié)構(gòu)是由2個(gè)苯環(huán)（A環(huán)和B 環(huán)）與3個(gè)碳原子橋連所形成的C6-C3-C6化合物[1]。由于多數(shù)黃酮類(lèi)化合物分子中存在A環(huán)和B 環(huán)與C3碳原子橋上的雙鍵組成的交叉共軛體系，在紫外吸收區(qū)域內(nèi)存在2個(gè)主要的峰帶Ⅰ和峰帶Ⅱ，其峰形可初步判斷黃酮類(lèi)化合物的母核結(jié)構(gòu)特征。累計(jì)已超過(guò)9 000個(gè)黃酮類(lèi)化合物在植物中被發(fā)現(xiàn)，成為天然產(chǎn)物中最大家族之一[2]。黃酮類(lèi)化合物具有抗菌、抗病毒、抗炎、保護(hù)心臟、抗糖尿病、抗癌、抗衰老等多種生理活性[3-5]。

湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所天然產(chǎn)物科室從湖北省利川市齊岳山（海拔1 500～1 600 m）采集藤茶（Ampelopsis grossedentata）樣品，藤茶為葡萄科（Vitaceae）蛇葡萄屬（Ampelopsis Michx.）植物。藤茶粗提取物（VTE）具有抗氧化、抗炎、保護(hù)肝臟、抗腫瘤、抗酪氨酸酶、抗糖尿病、降血脂等多種生理功能[6-8]。本試驗(yàn)采用乙醇溶液超聲提取藤茶總黃酮，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)雙波長(zhǎng)檢測(cè)藤茶幼嫩莖尖總黃酮含量;利用硅膠柱色譜及半制備高效液相色譜分離化合物，利用LC-HR-ESIMS、1D和2D NMR波譜數(shù)據(jù)分析，鑒定其結(jié)構(gòu);通過(guò)高效液相（HPLC）檢測(cè)分析其含量，以期為藤茶多糖的開(kāi)發(fā)提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料與儀器

藤茶樣品是從湖北省利川市齊岳山（海拔? ? ?1 500～1 600 m）采集，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所鑒定。

Bruker AV700超導(dǎo)核磁共振波譜儀（700/175 MHz，TMS為內(nèi)標(biāo)），Agilent 1260型高效液相色譜儀（配DAD檢測(cè)器），UV-1800型島津紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，Phenomenex色譜柱（50 mm×4.6 mm，ODS 5 μm）;Agilent Poroshell反相色譜柱120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）;HS-GF254硅膠薄層板;J & K色譜純乙腈;黃酮化合物化合物標(biāo)準(zhǔn)品二氫楊梅素[（2R，3R）-Dihydromyricetin]、楊梅素和花旗松素均購(gòu)自于阿拉丁試劑公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 藤茶乙醇提取物的獲得? 將恩施藤茶和西安藤茶打成粉末，共重710.31 g，用35.5 L的60%乙醇萃取，60%乙醇溶液浸泡18 h，500 W超聲提取30 min，取上清液過(guò)濾，取濾液旋蒸，得到浸膏200.27 g。

1.2.2? 藤茶乙醇提取物總黃酮檢測(cè)? 選用雙波長(zhǎng)檢測(cè)藤茶總黃酮含量[9]，取乙醇提取浸膏，用乙醇稀釋1×104倍備用，選用島津紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1800），檢測(cè)器設(shè)置波長(zhǎng)掃描范圍為190～700 nm，獲得待測(cè)藤茶稀釋樣品的吸收波峰。對(duì)比分析確認(rèn)藤茶樣品提取液中的物質(zhì)主要為黃酮類(lèi)化合物。選擇檢測(cè)波長(zhǎng)分別為208.4、293.2 nm，繪制二氫楊梅素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定各樣品黃酮化合物的含量。將標(biāo)準(zhǔn)品二氫楊梅素分別設(shè)置5個(gè)濃度梯度，并編號(hào)為standard 1、standard 2、standard 3、standard 4、standard 5，如表1所示。利用UVProbe 2.42 軟件繪制校正曲線，計(jì)算樣品濃度，再設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品加樣回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率，以保證試驗(yàn)方法的可靠性。

1.2.3? 藤茶乙醇提取物化合物的分離鑒定? 藤茶乙醇提取物浸膏用硅膠柱進(jìn)行分離，以石油醚/乙酸乙酯體系（100∶0、80∶20、50∶50、20∶80、0∶100，V/V）和乙酸乙酯/甲醇體系（80∶20、50∶50、0∶100，V/V）洗脫，得到8個(gè)組分Fr.A1～Fr.A40。根據(jù)HPLC和TLC分析結(jié)果，將Fr.A25～Fr.A28合并正向硅膠分離，以氯仿/甲醇體系（100∶0、98∶2、96∶4、94∶6、92∶8、90∶10、80∶20，V/V）洗脫，得到10個(gè)組分Fr.B1～Fr.B10。根據(jù)HPLC分析，經(jīng)半制備HPLC、ODS色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm）分離Fr.B5，以CH3CN/H2O（15∶85至100∶0，V/V）體系洗脫30 min，流速為2.5 mL/min，得到化合物3（tR=21.7 min，10 mg）。將組分Fr.A6、Fr.A7合并，經(jīng)半制備HPLC、ODS色譜柱分離，以CH3CN/H2O（15∶85至45∶55，V/V）體系洗脫30 min，流速為2.5 mL/min，得到化合物1（tR=11.5 min，30 mg）和化合物2（tR=15.3 min，12 mg）。

1.2.4? 藤茶乙醇提取物黃酮類(lèi)化合物含量的測(cè)定? 利用高效液相外標(biāo)法測(cè)定藤茶各黃酮化合物的含量。將標(biāo)準(zhǔn)品二氫楊梅素、楊梅素和花旗松素分別設(shè)置6個(gè)濃度梯度，配制成6組混標(biāo)樣品，高效液相數(shù)據(jù)處理軟件外標(biāo)法繪制校正曲線，計(jì)算樣品濃度，再設(shè)置加樣回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率，以保證試驗(yàn)方法的可靠性。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 藤茶乙醇提取物紫外吸收光譜

用島津紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)藤茶樣品，藤茶樣品在波長(zhǎng)510.4 nm處有最大吸收峰。選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為208.4、293.2 nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)藤茶樣品，利用UVProbe 2.42軟件繪制繪制二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品的校正曲線，方程為（x為Abs，y為濃度）：y=0.051 64x-0.009 13（r2=0.999 58）。

2.2? 藤茶乙醇提取物的總黃酮含量

采集于利川市齊岳山的3個(gè)藤茶樣品MDB1、MDB2、MDB3總黃酮類(lèi)化合物含量分別為441.0±4.5、480.0±15.5和440.0±14.0 mg/g，檢測(cè)到利川藤茶幼嫩部位干重總黃酮含量≥40%（表2），是已知報(bào)道的植物中總黃酮含量最高的物種之一。

2.3? 藤茶乙醇提取物黃酮類(lèi)化合物的鑒定及含量測(cè)定

藤茶乙醇提取物黃酮類(lèi)化合物鑒定結(jié)果表明，化合物1為白色無(wú)定型粉末，（+）HR-ESI-MS分析顯示其在m/z 321.1出現(xiàn)[M+H]+峰?；衔?的UV吸收光譜在218.7、292.5 nm處顯示2個(gè)最大吸收波長(zhǎng)，提示可能為黃酮母核結(jié)構(gòu)。1H NMR譜表明，該化合物含4個(gè)芳香質(zhì)子（2個(gè)δH 6.51、1個(gè)δH 5.84、1個(gè)δH 5.87），苯環(huán)上的2個(gè)芳香質(zhì)子δH 5.84、δH 5.87耦合，耦合常數(shù)為J=13.2 Hz，說(shuō)明2個(gè)鄰位或者間位。2個(gè)連氧次甲基質(zhì)子（δH 4.44，δH 4.84），耦合常數(shù)為J=11.2 Hz，說(shuō)明2個(gè)鄰位C上。13C NMR譜給出12個(gè)芳碳信號(hào)（C 96.4～C 168.7），其中除2個(gè)C 108.2（C-11、C-15）是苯環(huán)對(duì)稱(chēng)位置的非連氧芳碳，其余全是連氧碳。另有2個(gè)連氧次甲基碳（C 73.7、C 85.2）、1個(gè)羧基碳（δC 198.3）。結(jié)合化合物1的DEPT135譜信息推測(cè)，有6個(gè)季碳原子（C 73.7、C 85.2、C 96.4、C 97.5、C 108.2、C 108.2），其余全為叔碳?；衔?的1H和13C NMR化學(xué)位移值與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的二氫楊梅素的核磁譜相近，推斷該化合物為二氫楊梅素。

鑒定結(jié)果中，化合物2為綠色無(wú)定型粉末，（+）HR-ESI-MS分析顯示其在m/z 319.0出現(xiàn)[M+H]+峰?；衔?的UV吸收光譜在210.2、260.6、379.0 nm處顯示3個(gè)最大吸收波長(zhǎng)，提示可能為黃酮母核結(jié)構(gòu)?；衔?的1H及13C NMR數(shù)據(jù)與化合物1數(shù)據(jù)相似（表1），說(shuō)明化合物2是黃酮類(lèi)化合物。與化合物1相比，C-8=73.7，C-9=85.2化學(xué)位移值移動(dòng)到低場(chǎng)C-8=136.9、C-9=146.9。結(jié)合化合物2的DEPT135譜信息推測(cè)，2個(gè)季碳原子（C 73.7、C 85.2）的氫被取代，C8、C9形成雙鍵。化合物2的1H和13C NMR化學(xué)位移值與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的楊梅素的核磁譜相近，推斷該化合物為楊梅素。

鑒定結(jié)果表明，化合物3為綠色無(wú)定型粉末，（+）HR-ESI-MS分析顯示其在m/z 305.1出現(xiàn)[M+H]+峰。化合物3的UV吸收光譜在211.5、290.4 nm處顯示2個(gè)最大吸收波長(zhǎng)，提示可能為黃酮母核結(jié)構(gòu)?；衔?的1H及13C NMR數(shù)據(jù)與化合物1數(shù)據(jù)相似（表3），說(shuō)明化合物3是黃酮類(lèi)化合物。與化合物1相比，C-15=108.6化學(xué)位移值移動(dòng)到低場(chǎng)C-15=121.1，結(jié)合化合物3的DEPT135譜信息推測(cè)，C-15的-OH被-H取代。C15-H與鄰位C16-H耦合，耦合常數(shù)為J=11.6 Hz?；衔?的1H和13C NMR化學(xué)位移值與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的Taxifolin的核磁譜相近，推斷該化合物為花旗松素（Taxifolin）。

試驗(yàn)分離到的3個(gè)黃酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

2.4? 藤茶乙醇提取物黃酮類(lèi)化合物含量測(cè)定

利用高效液相外標(biāo)法測(cè)定利川市各黃酮化合物的含量：二氫楊梅素為186.31±10.43 mg/g、花旗松素為14.76±2.26 mg/g、楊梅素為13.83±1.32 mg/g。設(shè)置加樣回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率，如表4所示。3種黃酮類(lèi)化合物的回收率分別為91.36%、93.26%、92.52%。

3? 小結(jié)

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，利川市產(chǎn)區(qū)藤茶幼嫩莖尖總黃酮平均含量高達(dá)453.67±11.26 mg/g，是已知所有植物種類(lèi)中總黃酮含量最高的物種之一。從藤茶幼嫩莖尖乙醇提取物中分離鑒定了3個(gè)化合物：二氫楊梅素（1）、楊梅素（2）和花旗松素（3），并測(cè)定藤茶幼嫩莖尖中3種化合物的含量分別為186.31±10.43、13.83±1.32、14.76±2.26 mg/g。研究表明，二氫楊梅素具有抗氧化、抗神經(jīng)炎癥、神經(jīng)保護(hù)、抗老年癡呆癥、抗菌、抗癌等多種生理活性[12]。楊梅素具有抗炎、抗糖尿病和抗癌的作用[13]?；ㄆ焖伤鼐哂锌寡趸⒖寡?、保護(hù)心血管、保護(hù)肝臟、抗老年癡呆癥、抗菌和抗癌等多種生理活性[14]。目前，尚無(wú)關(guān)于藤茶植物體內(nèi)黃酮類(lèi)化合物的次級(jí)代謝途徑以及二氫楊梅素的大量積累機(jī)制的報(bào)道，后續(xù)將通過(guò)藤茶次級(jí)代謝產(chǎn)物分離鑒定和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，進(jìn)一步研究其黃酮類(lèi)化合物的次級(jí)代謝途徑以及二氫楊梅素的大量積累機(jī)制。

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