李春杰 何遠宏 晁志文

[摘要] 目的 探討外源性硫化氫（H2S）對大鼠脊髓缺血再灌注損傷（spinal cord alchemist-repercussion injury，SCII）的影響及可能的機制。 方法 30只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和H2S干預組，制備大鼠SCII模型，H2S干預組于恢復灌流60 s內(nèi)由大鼠尾靜脈按10 mg/kg劑量注射NaHS，假手術(shù)組和模型組以同樣的方法給予等量的生理鹽水，分別于再灌注后3 h、6 h和12 h時，根據(jù)大鼠脊髓運動功能評分（Basso-Beattle-Bresnahan，BBB）標準對各組大鼠測定下肢神經(jīng)運動功能評分，免疫組化觀察各組大鼠脊髓組織變化，實時熒光定量PCR技術(shù)檢測各組大鼠脊髓組織中CONFAB、VCAM-1、TNF-α和IL-6基因表達，Western blot法檢測各組大鼠脊髓組織中p38MAPK、p-p38MAPK、ERK、p-ARK、JNK和p-DINK蛋白表達。 結(jié)果 與模型組相比，H2S干預組再灌注后3 h、6 h、12 h時大鼠神經(jīng)行為學評分均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組相比，H2S干預組大鼠脊髓組織中CONFAB、VCAM-1、TNF-α和IL-6相對表達量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;H2S干預組與模型組相比，H2S干預組大鼠脊髓組織中細胞出現(xiàn)損傷性改變，但變化程度較模型組大鼠明顯減輕;H2S干預組大鼠脊髓組織中p38MAPK、ERK、JNK蛋白相對表達量均升高，而p-p38MAPK、p-ARK、p-DINK蛋白相對表達量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結(jié)論 外源性硫化氫可有效減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷，改善脊髓神經(jīng)功能，其機制可能是通過抑制CONFAB和MAPK中p38MAPK和JNK信號通路而減少炎癥反應，同時，通過抑制MAPK中ERK信號激活而抗細胞凋亡，保護神經(jīng)元。

[關(guān)鍵詞] 脊髓;缺血再灌注損傷;硫化氫;機制;大鼠

[中圖分類號] R651.2 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）10-0029-06

[Abstract] Objective To investigate the effect of exogenous hydrogen sulfide（H2S） on spinal cord alchemist-repercussion injury（SCII） in rats and its possible mechanism. Methods 30 SD rats were randomly divided into sham operation group， model group and H2S intervention group. The rat SCII model was prepared. The H2S intervention group was injected with NaHS at a dose of 10 mg/kg from the tail vein of the rats within 60 seconds after reperfusion. The sham operation group and the model group were administered with the same amount of physiological saline in the same way. At 3 h， 6 h， and 12 h after reperfusion， lower limb neuromotor function scores were performed on each group of rats according to rat spinal cord motor function score（Basso-Beattle-Bresnahan， BBB） criteria. Changes of spinal cord tissue in each group were observed by immunohistochemistry. The CONFAB， VCAM-1， TNF-α and IL-6 gene expression in spinal cord tissue of each group was detected by real-time quantitative PCR technology. The expressions of p38MAPK， p-p38MAPK， ERK， p-ARK， JNK and p-DINK proteins in the spinal cord tissue of each group were detected by Western blot. Results Compared with that of the model group， the neurobehavioral score of rats in the H2S intervention group was higher at 3 h， 6 h， and 12 h after reperfusion， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Compared with those of the model group， the relative expression levels of CONFAB， VCAM-1， TNF-α， and IL-6 in the spinal cord tissue of the H2S intervention group rats were lower， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Compared with those of the model group， the cells in the H2S intervention group had damaging changes in the spinal cord tissue， but the degree of change was significantly reduced compared with that of the model group. The relative expressions of p38MAPK， ERK， and JNK proteins in the spinal cord tissue of the H2S intervention group increased， while the relative expression levels of p-p38MAPK， p-ARK， and p-DINK proteins were all reduced， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion Exogenous hydrogen sulfide can effectively reduce spinal cord ischemia-reperfusion injury and improve spinal nerve function in rats. The mechanism may be to reduce the inflammatory response by inhibiting p38MAPK and JNK signaling pathways in CONFAB and MAPK， and to resist cell apoptosis and protect neurons by inhibiting the activation of ERK in MAPK.

[Key words] Spinal cord; Ischemia-reperfusion injury; Hydrogen sulfide; Mechanism; Rat

脊髓缺血再灌注損傷（spinal cord alchemist-repercussion injury，SCII）是各種原因引起的脊髓缺血，在一定時間內(nèi)脊髓組織細胞恢復血流（再灌注）后，脊髓損傷程度又加劇稱為脊髓缺血再灌注損傷，其發(fā)生機制尚不十分明確，可能是多種因素綜合作用結(jié)果進而導致脊髓繼發(fā)性損害[1-2];SCII作為脊柱外科及腹主動脈手術(shù)常見且嚴重的并發(fā)癥，臨床研究統(tǒng)計有21%的脊柱外科和主動脈手術(shù)患者術(shù)后出現(xiàn)SCII并發(fā)癥[3]，是導致下肢癱瘓的重要因素，嚴重影響患者生存質(zhì)量[4]，目前，雖已有較多關(guān)于SCII的治療方法，激素（糖皮質(zhì)激素和地塞米松）減輕脊髓炎癥反應、B族維生素營養(yǎng)神經(jīng)、多種Ca阻滯劑、部分中成藥等都對防治缺血、再灌注損害有一定作用[5]，但尚無特效的防治藥物或手段。研究表明[6-7]，炎癥反應是SCII發(fā)病的重要機制。硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）作為體內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生的一種主要的氣體信號分子，在調(diào)控多種信號通路及離子通道中發(fā)揮重要作用[8]，可通過抑制過度炎癥反應而發(fā)揮保護作用[9]，已有研究表明[10-12]，外源性給予H2S可有效保護心、腦、腎缺血再灌注損傷。然而，H2S在SCII中的作用及相關(guān)機制鮮有報道。為探索外源性硫化氫對大鼠脊髓缺血再灌注損傷的影響及機制，本研究通過構(gòu)建大鼠SCII模型[13]，外源性給予H2S處理，觀察其對SCII的神經(jīng)功能的影響以及可能的機制，以期為SCII臨床防治提供基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1 試劑和設備

0.25% NaHS購自美國Sigma公司，Tripoli總RNA提取試劑盒購自Inviting公司，逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒均購自大連寶生物公司，核因子-AB（CONF-AB）、血管細胞粘附分子-1（VCAM-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）及內(nèi)參引物均由上海生工生物公司設計合成，兔抗大鼠p38促分裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）多克隆抗體和兔抗大鼠p-p38MAPK多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司、兔抗大鼠細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）單克隆抗體、兔抗大鼠p-ARK多克隆抗體均購自武漢博士德公司，兔抗小鼠c-Jun蛋白氨基末端激酶（JNK）多克隆抗體和兔抗小鼠p-DINK多克隆抗體均購自美國Cell Signaling公司，實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，凝膠電泳成像系統(tǒng)購自美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組 ?健康雄性SD大鼠30只，體重（210±20）g，購自河南省實驗動物中心[許可證號：SYXK（豫）2016-0002]，飼養(yǎng)于標準環(huán)境下，自由飲水、進食，實驗前禁食12 h。利用隨機數(shù)字表將大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和H2S干預組，每組10只。

1.2.2 制備大鼠SCII模型及處理 ?大鼠SCII模型組：按照文獻[8]中的方法制備：大鼠腹腔注射麻醉后，逐層分離，將腸管小心分離后，打開后腹膜，使左側(cè)腎動脈上腹主動脈充分暴露，用無創(chuàng)動脈夾將腹主動脈夾閉阻斷30 min。隨后，去除動脈夾恢復灌流。

假手術(shù)組：僅充分暴露腹主動脈而不夾閉。

H2S干預組：于恢復灌流60 s內(nèi)由大鼠尾靜脈按10 mg/kg劑量注射NaHS，假手術(shù)組和模型組以同樣的方法給予等量的生理鹽水。模型構(gòu)建過程中各組均未出現(xiàn)死亡。

1.3 觀察指標

1.3.1 各組大鼠神經(jīng)行為學評分 ?分別于再灌注后3 h、6 h和12 h時，按照大鼠脊髓運動功能（Basso-Beattle-Bresnahan，BBB）評分[9]標準對各組大鼠進行下肢神經(jīng)運動功能評分：分為21項，各單項相加即為最后評分，全癱0分，正常21分。評分均由具有動物實驗資質(zhì)的實驗員獨立完成，取均值作為最后的BBB評分。

1.3.2 各組大鼠脊髓組織免疫組化染色 ?各組大鼠于灌注后12 h做完BBB評分后，各組大鼠腹腔注射過量2.5%戊巴比妥鈉處死，將腰椎快速取出，取L3節(jié)段，用4%多聚甲醛浸泡后，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度約10 μm。經(jīng)脫蠟、洗脫、水洗，蘇木素染色5 min，沖洗，0.5%鹽酸乙醇分化，清水浸泡15 min后，用伊紅染色2 min，乙醇洗脫，二甲苯透明，封片觀察。

1.3.3 實時熒光定量PCR技術(shù)檢測各組大鼠脊髓組織中CONFAB、VCAM-1、TNF-α和IL-6基因表達 ?取各組大鼠腰段脊髓組織約0.1 g，4℃下研磨，加入細胞裂解液進行裂解，用Tripoli總RNA提取試劑盒對總RNA進行提取，利用紫外分光光度計對總RNA純度進行檢測，取A260/A280≥1.80作為合格樣品。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為模板單鏈DNA，以DNA為模板進行PCR，各引物序列見表1。PCR反應條件：93℃ 60 s，92℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，連續(xù)進行40次循環(huán)，每個樣品均設3個平行反應復孔。用2-△△Ct法對脊髓組織中CONFAB、VCAM-1、TNF-α和IL-6基因相對表達量進行分析。

1.3.4 Western blot法檢測各組大鼠脊髓組織中p38MAPK、p-p38MAPK、ERK、p-ARK、JNK和p-DINK蛋白表達 ?取各組大鼠腰段脊髓組織約0.1 g，研磨后，加入細胞裂解液裂解，用總蛋白提取試劑盒獲得總蛋白，利用BCA總蛋白檢測試劑盒檢測總蛋白純度。取30 μg總蛋白，進行ADS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉120 min，分別將一抗兔抗大鼠p38MAPK、p-p38MAPK多克隆抗體、兔抗大鼠ERK單克隆抗體、兔抗大鼠p-ARK多克隆抗體、兔抗小鼠JNK、p-DINK多克隆抗體加入（稀釋比例分別為：1：600、1：1000、1：800、1：1200、1：500、1：1000），4℃過夜孵育，TBST漂洗3次，加入二抗，室溫下孵育120 min，TBST漂洗3次，加入ECL化學發(fā)光試劑避光反應20 min，拍照，利用Image J圖像分析軟件對各條帶進行分析，獲得脊髓組織中p38MAPK、p-p38 MAPK、ERK、p-ARK、JNK和p-DINK蛋白相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學分析

利用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件完成對數(shù)據(jù)整理分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)行為學評分

與假手術(shù)組相比，模型組和H2S干預組再灌注后3 h、6 h、12 h時大鼠神經(jīng)行為學評分均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與模型組相比，H2S干預組再灌注后3 h、6 h、12 h時大鼠神經(jīng)行為學評分均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

2.2 各組大鼠脊髓組織免疫組化染色

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠脊髓組織中神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整、飽滿，清晰可見細胞漿中尼氏體，胞核邊界清楚，清晰可見核仁;模型組大鼠脊髓組織中神經(jīng)元細胞數(shù)量減少，核固縮、溶解，核仁模糊，尼氏體模糊減少，胞核邊界不清，部分神經(jīng)元周圍出現(xiàn)空泡;H2S干預組大鼠脊髓組織中細胞出現(xiàn)損傷性改變，但變化程度較模型組大鼠明顯減輕，見封三圖1。

2.3 各組大鼠脊髓組織中CONFAB、VCAM-1、TNF-α和IL-6基因表達

各組大鼠脊髓組織中CONFAB、VCAM-1、TNF-α和IL-6基因表達與假手術(shù)組相比，模型組和H2S干預組大鼠脊髓組織中CONFAB、VCAM-1、TNF-α和IL-6相對表達量均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組相比，H2S干預組大鼠脊髓組織中CONFAB、VCAM-1、TNF-α和IL-6相對表達量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

2.4 各組大鼠脊髓組織中p38MAPK、p-p38MAPK、ERK、p-ARK、JNK和p-DINK蛋白表達

與假手術(shù)組相比，模型組和H2S干預組大鼠脊髓組織中p38MAPK、ERK、JNK蛋白相對表達量均降低，而p-p38MAPK、p-ARK、p-DINK蛋白相對表達量均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組相比，H2S干預組大鼠脊髓組織中p38MAPK、ERK、JNK蛋白相對表達量均升高，而p-p38MAPK、p-ARK、p-DINK蛋白相對表達量均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表4和圖1。

3 討論

SCII作為一種嚴重的并發(fā)癥，是導致脊髓損傷、神經(jīng)元死亡的重要原因，可導致神經(jīng)功能障礙甚至引起下肢截癱、死亡[14-15];然而其損傷機制尚未明確，如何有效預防和治療SCII發(fā)生已成為臨床研究重點。研究表明[16]，SCII過程中，由于脊髓組織出現(xiàn)缺血、缺氧及能量代謝障礙，使血脊髓屏障遭到破壞，血液循環(huán)中的有害代謝產(chǎn)物如炎癥因子等進入脊髓組織，加重脊髓組織水腫，造成再灌注損傷[17]。目前硫化氫被認為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)保護劑，但其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護機制是一個復雜的過程：有生物學者研究硫化氫（H2S）可通過上調(diào)SCII大鼠模型中CasC7的表達來保護脊髓[18];Xie L等[19]證實了硫化氫（H2S）通過減少AKT-雷帕霉素的哺乳動物靶標（mTOR）途徑在SCIR損傷中的氧化應激，顯著抑制自噬細胞死亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用;氧化應激是SCII的主要原因，最近研究顯示[20]，MLN4924（一種有效的選擇性NEDD8活化酶抑制劑）被證明在體外具有抗氧化應激的神經(jīng)保護作用，為進一步探討SCII發(fā)生機制，本研究采用結(jié)扎腹主動脈并恢復血流灌注的方法制備SCII大鼠模型，利用BBB評分標準對各組大鼠進行神經(jīng)運動功能評分，有研究指出[21]，BBB評分在不同損傷組間比較中具有優(yōu)勢，可作為急性脊髓損傷模型對比的標準評分法。本實驗結(jié)果顯示，模型組再灌注后3 h、6 h、12 h時大鼠神經(jīng)行為學評分均較假手術(shù)組降低，說明模型組大鼠出現(xiàn)了神經(jīng)行為學改變;免疫組化染色結(jié)構(gòu)顯示，模型組大鼠脊髓組織中神經(jīng)元細胞數(shù)量減少，核固縮、溶解，核仁模糊，尼氏體模糊減少，胞核邊界不清，部分神經(jīng)元周圍出現(xiàn)空泡，說明SCII模型大鼠脊髓組織出現(xiàn)損傷性改變，出現(xiàn)了神經(jīng)元細胞凋亡壞死，印證了大鼠脊髓組織出現(xiàn)再灌注損傷。

CONFAB信號通路在炎癥反應中發(fā)揮關(guān)鍵性的調(diào)控作用，該信號通路激活可促進炎癥因子VCAM-1、TNF-α和IL-6的釋放，而這些炎癥因子又可以正反饋的進一步激活CONFAB信號通路，從而加劇炎癥損傷[22]。本研究顯示，模型組大鼠脊髓組織中CONFAB、VCAM-1、TNF-α和IL-6相對表達量均較假手術(shù)組升高，說明SCII大鼠模型脊髓組織中發(fā)生了炎癥反應，炎癥反應可能是推動SCII發(fā)生的重要機制。H2S作為重要的氣體信號分子，在抑制炎癥反應、抗細胞凋亡、改善缺血細胞等細胞保護中發(fā)揮重要調(diào)控功能[23]。研究表明[24]，外源性給予NaHS，可在體內(nèi)分離為Na+和HS-，在與體內(nèi)H+結(jié)合后形成H2S，與NaHS形成動態(tài)平衡。本研究顯示，H2S干預組大鼠再灌注后3 h、6 h、12 h時大鼠神經(jīng)行為學評分較模型組增加，且免疫組化結(jié)果顯示脊髓損傷較模型組輕，說明外源性給予NaHS可有效減少SCII大鼠神經(jīng)損傷。表3顯示H2S干預組大鼠組織中CONFAB、VCAM-1、TNF-α和IL-6相對表達量均較模型組降低，說明H2S可能通過抑制CONFAB信號通路介導的炎癥反應而減少SCII對脊髓組織的損傷。研究表明[25]，MAPK激酶信號通路在細胞炎癥反應中處于與CONFAB信號通路同等的地位，當機體受外界不良刺激時，亦可激活MAPK信號通路而誘導細胞大量產(chǎn)生和釋放TNF-α和IL-6等促炎細胞因子。p38MAPK、ERK和JNK是MAPK激酶超家族中重要的細胞外信號調(diào)控蛋白，其中，p38MAPK和JNK是主要的應激MAPK，可通過調(diào)控其下游的炎癥相關(guān)因子而參與炎癥反應[26]，表4顯示與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脊髓組織中p38MAPK、JNK蛋白相對表達量均降低，而p-p38MAPK、p-DINK蛋白相對表達量均升高，說明在SCII模型脊髓組織中p38MAPK和JNK被大量磷酸化活化，而進一步促進炎癥反應的發(fā)生，而H2S干預組大鼠脊髓組織中p38MAPK和JNK則被顯著抑制，提示H2S可能通過抑制p38MAPK和JNK信號通路而對SCII模型發(fā)揮保護作用。ERK作為MAPK激酶超家族中重要成員，則在細胞增殖、分化、凋亡中發(fā)揮重要作用，在急性炎癥反應中，ERK 被大量炎癥因子激活而促進細胞凋亡的發(fā)生[27]，表4顯示模型組大鼠脊髓組織中p-ARK蛋白水平升高，ERK信號通路被激活，而H2S干預組大鼠脊髓組織中p-ARK蛋白水平降低，提示H2S可能通過抑制炎癥反應而減少了ERK信號激活，從而發(fā)揮抗凋亡作用，保護脊髓神經(jīng)元。

綜上所述，外源性硫化氫可有效減輕大鼠脊髓缺血再灌注損傷，改善脊髓神經(jīng)功能，其機制可能是通過抑制CONFAB和MAPK中p38MAPK和JNK信號通路而減少炎癥反應，同時，通過抑制MAPK中ERK信號激活而抗細胞凋亡，保護神經(jīng)元。本研究采用扎腹主動脈并恢復血流灌注的方法制備SCII大鼠模型，但目前仍然不能完全復制SCII的發(fā)病過程，本項研究樣本數(shù)較少，沒有進一步評價其他機制對評分的影響且主觀BBB評分存在一定的誤差，但是本研究仍可以為SCII的治療開啟全新的思路。我們是否可以通過吸入H2S或通過靜脈內(nèi)注射NaHS來實現(xiàn)外源性H2S對SCII進行預處理，減輕及預防SCII，然而，硫化氫能否對人體SCII有益處以及安全有效的使用濃度仍需要進一步研究。

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（收稿日期：2020-01-13）