秦 敏，賴偉華，李漢平，鐘詩龍*

0 引言

目前，冠心病(Coronary artery disease，CAD)的患病率和死亡率在全世界范圍內(nèi)居高不下[1-3]，其引導(dǎo)因素有很多種，血管內(nèi)斑塊的形成與血脂膽固醇異常升高和聚集密不可分。臨床診斷膽固醇異常主要通過檢測血漿中低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和總膽固醇(Cholesterol，CHOL)等指標(biāo)的含量。一項基于不同種族的前瞻性大規(guī)模隊列研究顯示，LDL-C是心血管事件有力且獨立的預(yù)測因子[4]。此外，在沒有主要心血管危險因素且LDL-C濃度處于正常水平的人群中，LDLC依然與早期系統(tǒng)性動脈粥樣硬化的發(fā)生和嚴(yán)重程度獨立相關(guān)[5]?？偰懝檀己窟^高本身不會引起癥狀，但會增加出現(xiàn)嚴(yán)重健康狀況的風(fēng)險[6]。因此，鑒別引起體內(nèi)膽固醇水平異常的不良因素和潛在機制對改善冠心病患者的早期診斷和不良預(yù)后極為重要。

冠心病患者體內(nèi)膽固醇水平個體差異極為顯著，其血漿濃度受到遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)、種族和環(huán)境等因素的共同影響。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是遺傳變異最為常見的一種形式，在臨床精準(zhǔn)醫(yī)療方面有重要的指導(dǎo)意義。前期基于歐洲白種人的研究發(fā)現(xiàn)，3個位于常染色體的rs4420638、rs2954021和rs660240變異不僅與循環(huán)LDL-C濃度相關(guān)，還與冠心病發(fā)生風(fēng)險顯著相關(guān)[7]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，ACE2基因上的多個SNP變異位點與血漿HDL-C濃度顯著相關(guān)[8]。然而，目前發(fā)現(xiàn)的與血脂膽固醇濃度相關(guān)的變異位點主要存在于常染色體中，線粒體基因變異和LDL-C、HDL-C及CHOL之間的關(guān)系仍不清楚。因此，識別新的與膽固醇顯著相關(guān)的線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)變異對解釋冠心病潛在病理機制有重要意義。

線粒體DNA變異是冠心病患者膽固醇水平異常的潛在遺傳學(xué)誘因之一。線粒體作為細(xì)胞的能量供應(yīng)場所，在冠狀動脈粥樣硬化血管病變中發(fā)揮著重要的作用[9]。mtDNA呈裸露的環(huán)狀雙鏈狀態(tài)，人線粒體基因組全長16.5 kb左右，共編碼37個基因[10]。mtDNA分為D環(huán)區(qū)(Displacement loop)和編碼區(qū)。D環(huán)區(qū)雖無編碼功能，但參與復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，其堿基處于高度可變狀態(tài)。D環(huán)區(qū)以外的序列均為外顯子并編碼基因。因此，相對于常染色DNA變異，線粒體基因SNP變異更有可能發(fā)生在編碼區(qū)并直接影響其所編碼的基因所參與調(diào)控的生理學(xué)功能。研究顯示，線粒體中的膽固醇過多會導(dǎo)致線粒體功能障礙，并通過線粒體膜順序的改變而導(dǎo)致細(xì)胞谷胱甘肽的線粒體轉(zhuǎn)運載體損傷[11-13]。此外，先前的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體中膽固醇的過度積累與心血管組織中線粒體損傷和心肌缺血損傷具有重要聯(lián)系[14]，同時，線粒體的累積損傷又與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[15]。由此可見，LDL-C等血脂伴隨的膽固醇過度積累可能通過損傷線粒體功能而誘導(dǎo)動脈粥樣硬化的產(chǎn)生。

目前發(fā)現(xiàn)的與循環(huán)膽固醇濃度相關(guān)的線粒體SNP變異位點較少。最早有研究發(fā)現(xiàn)，在白人運動員中，線粒體DNA單倍型類群HV與LDL-C的升高有關(guān)，而單倍型JT則與LDL-C的降低相關(guān)[16]。Honmyo等[17]發(fā)現(xiàn)，線粒體基于RNR2上的5178C→A多態(tài)性與血漿升高的HDL-C濃度顯著相關(guān)。此外，一項基于中國高血壓患者的研究也顯示，線粒體tRNAMet突變與血漿CHOL和HDL-C顯著相關(guān)[18]。然而，幾乎沒有研究關(guān)注中國冠心病患者線粒體基因組遺傳變異與LDL-C、HDL-C和CHOL的關(guān)系。本研究擬采用基因芯片測序的方法，分析全部線粒體基因SNP位點與冠心病患者血漿LDL-C、HDL-C和CHOL濃度的相關(guān)性，找到新的影響血脂LDL-C、HDL-C和CHOL濃度的變異位點，為冠心病患者的精準(zhǔn)降膽固醇治療提供新的理論依據(jù)和潛在藥物分子靶點。

1 材料和方法

1.1 研究對象及入排標(biāo)準(zhǔn) 本研究共入選857例確診為穩(wěn)定型冠心病的患者。所有患者均接受經(jīng)皮冠狀動脈介入手術(shù)(PCI)治療并服用降膽固醇藥物阿托伐他汀。這些患者均從廣東省人民醫(yī)院心內(nèi)科入選，入選時間為2010年2月至2014年1月。入選病例的基線資料從廣東省人民醫(yī)院病歷系統(tǒng)查詢。所有患者均詳細(xì)記錄其年齡、性別、既往病史(糖尿病、心衰和高血壓)、用藥史[β受體阻滯劑(BB)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)、鈣離子通道拮抗劑(CCB)和質(zhì)子泵抑制劑(PPI)]和入院時的生化指標(biāo)檢測情況(肝功能、肌酐、血脂和血糖等)。本研究經(jīng)廣東省人民醫(yī)院的醫(yī)學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)，納入研究的每位患者均簽署了知情同意書。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～80歲的經(jīng)冠狀動脈造影術(shù)(CAG)確診為穩(wěn)定型冠心病并行PCI治療的中國漢族人；排除標(biāo)準(zhǔn)(凡符合以下任意一條即被排除)：伴隨腎功能不全(血清肌酐水平>230 μmol/L)或腎移植、肝功能不全(血轉(zhuǎn)氨酶水平>80 U/L)或肝硬化、處于孕期以及并發(fā)癌癥等惡病的患者。

1.2 試劑與儀器 自動核酸提取儀(TGuide M16，天根生化科技有限公司，北京)；血液基因組DNA提取試劑盒(OSR-M102，天根生化科技有限公司，北京)；NanoDrop 2000(Thermo Scientific，美國)；低速離心機(Eppendorf，美國)；TAE緩沖液(廣州威佳科技有限公司，中國)；瓊脂糖(9012-36-3，BIOWEST，美國)；EB替代品GelRed(Biotium，美國)；Gel Doc 1000凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad，美國)；核酸電泳儀(JM-250，大連捷邁科技有限公司，中國)，Syngo Dynamics心血管成像軟系統(tǒng)(Siemens Medical Solutions，美國)。

1.3 血樣采集 為降低食物或營養(yǎng)物質(zhì)對血脂水平的影響，入選患者于每日凌晨空腹采集血樣4 ml于EDTA抗凝管中。隨后，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離血細(xì)胞和血漿，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血細(xì)胞基因組DNA提取 利用自動核酸提取儀以及配套的血液基因組DNA提取試劑盒從血細(xì)胞中提取基因組DNA。獲得的基因組DNA采用超微量生物檢測儀NanoDrop 2 000進行初步的純度檢測，要求1.8≤A260/A280<2.0，A260/A230>2.0。純度符合要求的DNA隨后進行瓊脂糖凝膠電泳，以判斷DNA分子的完整性，要求DNA樣品條帶清晰明亮，無拖尾或不規(guī)則遷移。

1.5 基因分型 經(jīng)純度和完整性質(zhì)檢合格后的DNA樣品采用Illumina公司的GSA芯片[Infinium Global Screening Array-24 v1.0(GSA)Bead Chip]進行全基因組DNA分型。GSA芯片是一款先進的基因分型芯片，包含大量功能基因位點，被用于群體規(guī)模的遺傳研究、編譯篩選和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究。該芯片可成功分型700 078個SNP位點，其中140個SNP位點位于線粒體基因上。

2 結(jié)果

2.1 基線資料 本研究共順序入選857例經(jīng)PCI術(shù)治療的冠心病患者，其臨床基線資料統(tǒng)計情況見表1。本隊列人群LDL-C、HDL-C和CHOL的平均水平分別為(2.98±0.94)、(0.96±0.25)、(4.29±1.13)mmol/L。

2.2 mtDNA變異與LDL-C的相關(guān)性 線粒體基因和LDL-C關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示(圖1)，在51個線粒體SNP位點中，排除年齡、性別和肝腎功能對LDL-C的影響后，3個SNP位點與LDL-C顯著相關(guān)(P<0.05)，分別為G513A、G3010A和C1048T，而G513A在經(jīng)過FDR校正后依然表現(xiàn)出與LDL-C顯著相關(guān)(FDR=0.033，表2和圖2)。在這3個位點中，攜帶G513A和1048T突變基因型患者體內(nèi)LDL-C水平高于野生型，而攜帶3010A突變基因型患者體內(nèi)LDL-C水平低于野生型，每個位點的基因型與具體LDL-C濃度的關(guān)系見表3。

2.3 mtDNA變異與HDL-C的相關(guān)性 全部線粒體SNP位點與HDL-C血漿水平的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示，4個SNP位點與HDL-C水平顯著相關(guān)(P<0.05)，分別為G1438A、C11536T、G7853A和T14502C，所有位點FDR校正后差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。在這4個位點中，攜帶11536T和7853A任意一種突變基因型的患者血漿HDL-C水平均高于野生型；而攜帶1438A和14502C任意一種突變基因型的患者血漿HDL-C水平均低于野生型(圖3)，具體結(jié)果見表3。

表1 857例冠心病患者臨床基線資料統(tǒng)計情況

2.4 mtDNA變異與CHOL的相關(guān)性 與CHOL的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，4個SNP與血漿總膽固醇濃度顯著相關(guān)(P<0.05)，分別為G513A、G3010A、C8964T和G1438A，所有位點經(jīng)FDR校正后差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。這4個位點的基因型與血漿CHOL的對應(yīng)關(guān)系如表3和圖4所示，除G513A以外，攜帶其余3個位點中任意一個位點的患者體內(nèi)總膽固醇水平均低于無突變者。此外，G513A和G3010A同時與LDL-C和CHOL顯著相關(guān)，G1438A同時與HDL-C和CHOL顯著相關(guān)(P<0.05)。

2.5 與膽固醇相關(guān)的mtDNA變異與BNP的關(guān)系 為了闡明這些與血漿膽固醇濃度顯著相關(guān)的mtDNA變異位點與冠心病患者心功能的相關(guān)性，本研究進一步分析了上述8個位點與BNP濃度>500 ng/L和≤500 ng/L的相關(guān)性。結(jié)果如表4所示，在這8個位點中，與HDL-C顯著相關(guān)的T14502C位點與BNP濃度升高顯著相關(guān)，剩余7個位點差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。這些結(jié)果表明，T14502C位點變異可能會引起冠心病患者體內(nèi)有益脂質(zhì)HDL-C降低，從而導(dǎo)致心功能紊亂。

表2 線粒體DNA變異和血漿各類膽固醇濃度的相關(guān)性

圖1 51個線粒體SNP與血漿LDL-C、HDL-C和CHOL濃度關(guān)聯(lián)性分析

圖2 線粒體變異位點G513A、C1048T和G3010A對血漿LDL-C濃度的影響

圖3 線粒體變異位點G1438A、G7853A、T14502C和C11536T對血漿HDL-C濃度的影響

圖4 線粒體變異位點G3010A、G1438A、C8964T和G513A對血漿CHOL濃度的影響

3 討論

本文分析了857例冠心病患者mtDNA變異與血漿中各類膽固醇(LDL-C、HDL-C和CHOL)的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3、4、4個SNP位點分別與LDL-C、HDL-C、CHOL顯著相關(guān)，并且G513A在經(jīng)過FDR校正后依然與LDL-C顯著相關(guān)。此外，進一步分析發(fā)現(xiàn)，G513A和G3010A同時與LDL-C和CHOL顯著相關(guān)，G1438A同時與HDL-C和CHOL顯著相關(guān)。進一步分析還發(fā)現(xiàn)，與HDL-C顯著相關(guān)的位點T14502C還與冠心病患者心功能變差相關(guān)。這些研究結(jié)果為進一步解釋冠心病患者體內(nèi)膽固醇水平差異大和不良預(yù)后提供了潛在的理論基礎(chǔ)，并為冠心病患者的精準(zhǔn)醫(yī)療提供了潛在的藥物干預(yù)靶點。

表3 8個候選SNP不同基因型間血漿LDL-C、HDL-C和CHOL濃度的差異

表4 與膽固醇相關(guān)的SNP變異與心功能的相關(guān)性

本研究發(fā)現(xiàn)的8個與LDL-C、HDL-C和CHOL水平顯著相關(guān)的線粒體SNP變異中，G513A位于線粒體基因D環(huán)區(qū)，C1048T和G1438A位于MT-RNR1基因上，G3010A位于MT-RNR2基因上，C11536T和T14502C位于MT-ND基因家族，剩余2個位點G7853A和C8964T分別位于MT-CO2和MT-ATP6基因。

通過對線粒體基因變異和血漿膽固醇濃度的關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，位于線粒體基因D環(huán)區(qū)的G513A變異位點與冠心病患者血漿LDL-C和CHOL水平的相關(guān)性最為顯著，且攜帶513A堿基的患者血漿CHOL和LDL-C濃度均顯著高于攜帶513G堿基的患者，表明該位點變異可能導(dǎo)致患者體內(nèi)循環(huán)膽固醇濃度上升，從而加重動脈粥樣硬化的進展。線粒體D環(huán)區(qū)雖然不編碼任何功能性的蛋白質(zhì)，但已確認(rèn)D環(huán)區(qū)包含重鏈復(fù)制的初始位點以及輕鏈和重鏈的轉(zhuǎn)錄啟動子序列。因此，D環(huán)區(qū)是線粒體DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的必要調(diào)控區(qū)域。此外，研究表明，線粒體DNA為了應(yīng)對氧化應(yīng)激，D環(huán)區(qū)的累計突變率顯著高于mtDNA其他區(qū)域[19]。這種高突變率與多種病理生理表現(xiàn)相關(guān)，早期研究發(fā)現(xiàn)，D環(huán)區(qū)的mtDNA T16189C突變是誘導(dǎo)胰島素抵抗的遺傳因素，并可能與成年人心血管疾病和中風(fēng)伴隨的血管病變相關(guān)[20]。綜上，線粒體基因D環(huán)區(qū)DNA變異可導(dǎo)致包括心血管疾病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生，本研究發(fā)現(xiàn)，同時與LDL-C和CHOL顯著相關(guān)的位于D環(huán)區(qū)的G513A位點可能是冠脈粥樣硬化患者血管病變的潛在誘發(fā)因素。

本研究發(fā)現(xiàn)，MT-ND411536C→T和MT-ND614502T→C與血漿HDL-C顯著相關(guān)，這2個位點所在基因編碼線粒體NADH脫氫酶(MD-ND)家族，也稱為復(fù)合物Ⅰ，分別構(gòu)成復(fù)合物的亞基4和亞基6。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MT-ND614502T→C屬于錯義突變，可導(dǎo)致原密碼子所編碼的異亮氨酸變?yōu)槔i氨酸(Ile->Val)。NADH脫氫酶是呼吸系統(tǒng)電子傳遞鏈中最大的復(fù)合物[21]，從糖和脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的NADH中獲得能量，并將能量轉(zhuǎn)化為橫跨線粒體內(nèi)膜的電位差，隨后此電位差被用于合成ATP[22]。由于復(fù)合物Ⅰ對能量供應(yīng)至關(guān)重要，當(dāng)其功能發(fā)生紊亂時，多種疾病也隨之而來。一項基于日本人的研究顯示，MT-ND25178A→C多態(tài)性與血清HDL-C和TG水平顯著相關(guān)[17]。此外，最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，NADH脫氫酶亞基6基因P25L(ND6P25L)突變可顯著增加心肌病的嚴(yán)重程度[23]。本研究也發(fā)現(xiàn)，MT-ND6基因上的14502T→C變異可以導(dǎo)致血漿有益膽固醇HDL-C濃度降低，從而導(dǎo)致心功能變差。然而，復(fù)合物Ⅰ調(diào)控HDL-C血漿濃度，繼而引起心功能降低的潛在分子機制尚不清楚，亟待進一步的研究對本文所述位點進行多中心隊列的驗證和潛在分子機制的研究。

除了MT-ND基因家族與血脂水平顯著相關(guān)以外，本研究發(fā)現(xiàn)，MT-CO2G7853A和HDL-C水平顯著相關(guān)，該位點位于線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基2(MT-CO2)基因外顯子區(qū)，其突變引起原密碼子所編碼的纈氨酸被異亮氨酸替代(Val->Ile)，從而阻止MT-CO2蛋白質(zhì)正常生理學(xué)功能的發(fā)揮。MT-CO2編碼的蛋白質(zhì)共包含226個氨基酸，構(gòu)成細(xì)胞色素C氧化酶(復(fù)合物Ⅳ)的第2個亞基，主要參與線粒體呼吸鏈中催化氧氣還原為H2O的過程。MT-CO2突變將導(dǎo)致線粒體復(fù)合物Ⅳ合成不足[24]，而復(fù)合物Ⅳ的缺乏與心肌肥厚[25]和肌張力低下[26-27]等多種臨床表型相關(guān)。本文首次發(fā)現(xiàn)7853G→A突變可引起中國冠心病患者體內(nèi)血脂HDL-C水平升高，這表明冠心病患者血脂HDL-C濃度水平個體差異大可部分歸因于線粒體基因多態(tài)性。然而，該變異與HDL-C血漿濃度之間的分子機制理論基礎(chǔ)還有待進一步觀察。

MT-RNR11048C→T、MT-RNR11438G→A和MT-RNR2G3010A所在基因分別編碼線粒體中12S核糖體RNA(12S rRNA)和16S核糖體RNA(16S rRNA)。12S rRNA主要參與胰島素敏感性和代謝平衡調(diào)控過程。此外，該蛋白作為葉酸循環(huán)的抑制劑，可以減少嘌呤的從頭合成，從而導(dǎo)致嘌呤從頭合成通路中間體5-氨基咪唑-4-羧酰胺(AICAR)的積累和代謝調(diào)節(jié)劑5′-磷酸腺苷依賴的蛋白激酶(AMPK)的活化。研究發(fā)現(xiàn)，MT-RNR1基因A1555G變異與人類主動脈的動脈粥樣硬化病變顯著相關(guān)[10]，該位點在其他隊列的研究中同樣被證實[28]。另外，MT-RNR1基因突變同樣可以造成線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ缺乏，從而對人體各個器官或組織造成不同程度的影響。流行病學(xué)研究顯示，復(fù)合物Ⅳ缺乏患者常表現(xiàn)出心室肥厚這一臨床表型[25]。這些研究表明，線粒體MT-RNR1基因變異在冠狀動脈粥樣硬化病變中起著重要的作用，而本研究發(fā)現(xiàn)，該基因與血漿膽固醇顯著相關(guān)，提示該基因可能通過調(diào)控血漿中膽固醇的含量而參與動脈粥樣硬化病變過程。

MT-ATP6C8964T位點所在基因編碼線粒體中的ATP合成酶膜亞基6。該酶也被稱為復(fù)合物Ⅴ，參與電子傳遞鏈中氧化磷酸化的最后一步。MT-ATP6基因突變可導(dǎo)致線粒體復(fù)合物Ⅴ缺乏，該復(fù)合物缺乏的常見的臨床表現(xiàn)為肥厚型心肌病，并可導(dǎo)致心衰。當(dāng)ATP合成酶生物合成被改變時，該酶在結(jié)構(gòu)上被修飾且其生理學(xué)功能無法正常進行。此時，細(xì)胞能量供應(yīng)受到損害，導(dǎo)致ROS生成失調(diào)[29]。此外，人肝細(xì)胞表面存在線粒體ATP合酶的2個主要蛋白，即α鏈和β鏈，與HDL分解代謝有關(guān)，可調(diào)控體內(nèi)膽固醇的含量[30]。然而，細(xì)胞如何將這些蛋白質(zhì)引導(dǎo)至細(xì)胞表面以及如何調(diào)節(jié)其細(xì)胞表面的表達尚不清楚，需要進一步研究。

本研究有針對性地分析了線粒體DNA變異與冠心病患者血漿各類膽固醇的相關(guān)性，結(jié)果初步發(fā)現(xiàn)了3、4、4個(8個唯一的)SNP位點分別與血漿LDL-C、HDL-C和CHOL顯著相關(guān)，其中位于D環(huán)區(qū)的G513A經(jīng)FDR校正之后依然與LDL-C顯著相關(guān)，與HDL-C顯著相關(guān)的T14502C變異與心功能變差相關(guān)?？傊?，本研究證實，冠心病患者體內(nèi)膽固醇水平差異大可部分歸因于線粒體基因的單核苷酸多態(tài)性，這為進一步解釋動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的機制提供了潛在的遺傳學(xué)理論基礎(chǔ)，并為冠心病患者的精準(zhǔn)治療提供了潛在的藥物分子靶點。