沈云玲，魏 靜，徐小宇

0 引言

隨著人口老齡化的增長(zhǎng)，骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)已成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，影響著數(shù)百萬(wàn)人的日?；顒?dòng)和生活質(zhì)量，為患者帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。因此，深入研究骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生機(jī)制和防治措施對(duì)于提高患者的生活質(zhì)量和降低死亡率具有重要意義。

骨重塑是調(diào)節(jié)骨結(jié)構(gòu)和功能的主要代謝過(guò)程，主要與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收過(guò)程和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成過(guò)程相關(guān)[2]。異常情況下，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收活性增強(qiáng)將導(dǎo)致骨代謝性疾病的發(fā)生，如骨質(zhì)疏松癥[3]。核因子(NF)-κB作為一種重要的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，其對(duì)于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化形成具有重要意義[4]。除此之外，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與介導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及發(fā)育等多種過(guò)程，其通過(guò)調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化及增殖參與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和發(fā)展[5]。阿侖膦酸鈉是一種骨吸收抑制劑，其能夠通過(guò)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡抑制骨吸收過(guò)程，廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的治療，但是其抗骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制尚不明確[6]。因此，本研究采用骨質(zhì)疏松大鼠模型探討了阿侖膦酸鈉對(duì)骨質(zhì)疏松癥的作用及相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 p-p65、p65、p-p50、p50、p-JNK、p-p38、p-ERK及GAPDH抗體(CST，美國(guó))；HRP標(biāo)記山羊抗兔IG(Abcam，中國(guó))；RIPA蛋白裂解液(中)、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(碧云天，中國(guó))；阿侖膦酸鈉片(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)，中國(guó))；氨芐青霉素(威仕特，加拿大)；蘇木精-伊紅染色液(碧云天，中國(guó))；鈣、磷、E2、IL-6及IL-1β大鼠ELISA試劑盒(聯(lián)科，中國(guó))。

1.2 動(dòng)物分組及給藥 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)的同意和批準(zhǔn)，將50只雌性SD大鼠[(250±5)g]隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及阿侖膦酸鈉組(ALN-25 μg/kg、ALN-50 μg/kg和ALN-100 μg/kg)，每組10只，術(shù)后8周開(kāi)始灌胃給藥ALN，每天1次，連續(xù)8周，假手術(shù)組和模型組均灌胃給予等體積的生理鹽水。

1.3 骨質(zhì)疏松大鼠模型的建立 采用雙側(cè)卵巢切除法建立骨質(zhì)疏松大鼠模型，造模前，大鼠禁食12 h，在第0周，腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，從大鼠背部脊柱兩側(cè)，分離并切除雙側(cè)卵巢；假手術(shù)組僅切除卵巢附近的脂肪組織，術(shù)后縫合傷口，計(jì)手術(shù)當(dāng)周為第0周，連續(xù)肌肉注射4 d抗生素(氨芐青霉素，4×104U/d)。

1.4 骨密度(BMD)檢測(cè) 在第16周給藥結(jié)束后，腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠，平放于雙能X線吸收測(cè)量?jī)x上，測(cè)量大鼠全身的骨密度(g/cm2)。

1.5 血液指標(biāo)檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中鈣、磷、E2、IL-6及IL-1β的分泌水平，在第16周給藥結(jié)束后，大鼠眼球取血，用1.5 ml EP管收集，4 ℃靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，吸取上清立即檢測(cè)或置于-80 ℃保存。

1.6 HE病理染色 在第16周給藥結(jié)束后，大鼠脫頸椎處死，分離收集實(shí)驗(yàn)大鼠的股骨組織，置于4%多聚甲醛固定24 h，然后用EDTA脫鈣液(10%，pH 8.0)脫鈣15 d，每3天更換1次，石蠟包埋，切成4 μm薄片，蘇木精-伊紅染色，觀察病理變化。

1.7 Micro-CT 分離大鼠的股骨組織，固定于4%多聚甲醛中，并且使用Micro-PET/CT掃描儀(Inveon，Siemens，Berlin，Germany)分析遠(yuǎn)端股骨，掃描儀的分辨率為10 μm，管電壓為50 kV，管電流為400 μA。

1.8 蛋白印跡免疫分析(Western blot) 大鼠脫頸椎處死，分離收集實(shí)驗(yàn)大鼠的股骨組織，稱取約50 mg，采用Western blot檢測(cè)大鼠股骨組織中p-p65、p65、p-p50、p50、p-JNK、p-p38、p-ERK的蛋白表達(dá)水平。根據(jù)說(shuō)明書操作提取組織總蛋白，采用BCA法(碧云天，中國(guó))對(duì)蛋白進(jìn)行定量，加入Loading buffer(4×)于100 ℃煮沸5 min，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳來(lái)達(dá)到分離蛋白的目的，電泳條件：80 V，30 min；120 V，60 min。隨后采用100 V，90 min，將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏佛乙烯(PVDF)膜(Millipore，美國(guó))，用5%脫脂奶粉封閉60 min，TBST洗滌5次，5 min/次，用一抗(p-p65、p65、p-p50、p50、p-JNK、p-p38、p-ERK及GAPDH，按1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌5次，5 min/次，用二抗(HRP標(biāo)記山羊抗兔IG，按1∶10 000稀釋)孵育90 min，TBST洗滌5次，5 min/次。用ECL化學(xué)發(fā)光法(Millipore，MA)顯影檢測(cè)，Image J分析灰度值，GAPDH用作內(nèi)參對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 阿侖膦酸鈉對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度(BMD)的影響 骨密度檢測(cè)結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的骨密度值顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，25、50、100 μg/kg劑量的阿侖膦酸鈉組大鼠的骨密度值顯著增加(P<0.05)。表明本研究成功建立了骨質(zhì)疏松大鼠模型，阿侖膦酸鈉對(duì)骨質(zhì)疏松癥具有一定的緩解作用。見(jiàn)圖1。

圖1 阿侖膦酸鈉對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響

2.2 阿侖膦酸鈉對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝相關(guān)血液學(xué)指標(biāo)的影響 采用ELISA法檢測(cè)骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝相關(guān)的血液學(xué)指標(biāo)變化，結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中鈣、磷的水平顯著下調(diào)(P<0.05)；灌胃給予阿侖膦酸鈉呈劑量依賴性上調(diào)骨質(zhì)疏松大鼠血清中鈣、磷的水平(P<0.01或P<0.05)。見(jiàn)圖2A。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中E2的水平顯著下調(diào)(P<0.01)，IL-1β及IL-6的水平顯著上調(diào)(P<0.01)；與模型組相比，灌胃給予阿侖膦酸鈉呈劑量依賴性上調(diào)骨質(zhì)疏松大鼠血清中E2的水平(P<0.05)，下調(diào)IL-1β、IL-6的水平(P<0.05)。見(jiàn)圖2B。

2.3 阿侖膦酸鈉對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨結(jié)構(gòu)變化的影響 采用HE染色和Micro-CT檢測(cè)骨質(zhì)疏松大鼠股骨結(jié)構(gòu)的變化。HE染色結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組大鼠的股骨結(jié)構(gòu)出現(xiàn)骨丟失；與模型組相比，灌胃給予阿侖膦酸鈉呈劑量依賴性改善骨質(zhì)疏松大鼠的股骨結(jié)構(gòu)(圖3A)。Micro-CT結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組大鼠股骨組織中骨小梁出現(xiàn)缺失；與模型組相比，灌胃給予阿侖膦酸鈉呈劑量依賴性改善骨質(zhì)疏松大鼠股骨的骨小梁結(jié)構(gòu)(圖3B)。

圖2 阿侖膦酸鈉對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝相關(guān)血液學(xué)指標(biāo)的影響

注：A.骨質(zhì)疏松大鼠血清中鈣、磷的水平；B.骨質(zhì)疏松大鼠血清中E2、IL-1β、IL-6的水平。與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術(shù)組比較，##P<0.01

2.4 阿侖膦酸鈉對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織中NF-κB信號(hào)通路活化的影響 采用Western blot法檢測(cè)骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織中NF-κB通路相關(guān)分子的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明,與假手術(shù)組相比，模型組大鼠股骨組織中p-p50/p50、p-p65/p65的表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01)；與模型組相比，給予阿侖膦酸鈉呈劑量依賴性下調(diào)骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織中p-p50/p50、p-p65/p65的表達(dá)水平(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

2.5 阿侖膦酸鈉對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織中MAPK信號(hào)通路活化的影響 采用Western blot法檢測(cè)骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織中MAPK信號(hào)通路相關(guān)分子的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明,與假手術(shù)組相比，模型組大鼠股骨組織中p-JNK、p-p38及p-ERK的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)；與模型組相比，給予阿侖膦酸鈉呈劑量依賴性下調(diào)骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織中p-JNK、p-p38及p-ERK的表達(dá)水平(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖3 阿侖膦酸鈉對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨結(jié)構(gòu)變化的影響

圖4 阿侖膦酸鈉對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織中NF-κB信號(hào)通路的影響

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種常見(jiàn)的骨代謝性疾病，發(fā)病率和致殘率較高，影響著全世界數(shù)百萬(wàn)人的生活質(zhì)量[7]。阿侖膦酸鈉是一種骨吸收抑制劑，應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的治療。研究表明，高劑量的阿侖膦酸鈉能夠誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的凋亡，從而產(chǎn)生抗骨質(zhì)疏松的作用[6]，但是阿侖膦酸鈉抗骨質(zhì)疏松的具體作用機(jī)制仍不明確。因此，本研究采用骨質(zhì)疏松大鼠模型，探索阿侖膦酸鈉是否通過(guò)NF-κB和MAPK通路產(chǎn)生抗骨質(zhì)疏松作用。

骨重塑是一個(gè)動(dòng)態(tài)的骨代謝過(guò)程，在成年人骨骼的調(diào)節(jié)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，其主要由破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收過(guò)程和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成過(guò)程維持，當(dāng)平衡傾向于骨吸收過(guò)程時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致骨流失，最終導(dǎo)致骨代謝相關(guān)疾病的發(fā)生，如骨質(zhì)疏松癥[5,8-9]。研究表明，骨質(zhì)疏松大鼠血清中鈣、磷水平與骨質(zhì)疏松癥的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，除此之外，骨質(zhì)疏松大鼠血清中雌激素(E2)水平會(huì)顯著下調(diào)[10-12]。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠血清中鈣、磷及E2水平顯著下降，與上述報(bào)道結(jié)果一致。同時(shí)，本研究結(jié)果表明，給予阿侖膦酸鈉能夠上調(diào)骨質(zhì)疏松大鼠血清的鈣、磷及E2水平。IL-1β和IL-6作為重要的細(xì)胞炎癥因子，在破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收過(guò)程中起著重要的作用。研究表明，骨質(zhì)疏松癥大鼠血清中IL-1β和IL-6水平顯著上調(diào)[13]，這與本研究結(jié)果一致。同時(shí)，本研究結(jié)果表明，阿侖膦酸鈉能夠顯著下調(diào)骨質(zhì)疏松大鼠血清中IL-1β和IL-6的水平，表明阿侖膦酸鈉能夠通過(guò)改善骨代謝相關(guān)血液學(xué)指標(biāo)緩解骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展。

圖5 阿侖膦酸鈉對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織中MAPK信號(hào)通路的影響

為了進(jìn)一步探索阿侖膦酸鈉的抗骨質(zhì)疏松作用，本研究采用HE染色和Micro-CT觀察股骨結(jié)構(gòu)的變化。HE染色結(jié)果表明，模型組大鼠的股骨結(jié)構(gòu)出現(xiàn)骨丟失，給予阿侖膦酸鈉能夠改善骨質(zhì)疏松大鼠的股骨結(jié)構(gòu)，防止骨丟失。Micro-CT結(jié)果表明，模型組大鼠股骨組織中骨小梁出現(xiàn)大面積缺失，灌胃給予阿侖膦酸鈉呈劑量依賴性改善骨小梁骨丟失，上述結(jié)果表明，阿侖膦酸鈉能夠改善骨質(zhì)疏松大鼠的骨結(jié)構(gòu)。

NF-κB信號(hào)通路對(duì)于破骨細(xì)胞的形成和活化至關(guān)重要，在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展過(guò)程中具有關(guān)鍵性作用[14]。正常情況下，p65或p50與IκBα形成共聚體存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)受到細(xì)胞外信號(hào)的刺激(如RNAKL、LPS)，IκBα發(fā)生磷酸化并降解，p65或p50進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)破骨細(xì)胞形成和活化相關(guān)信號(hào)分子的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成和活化[15]。本研究結(jié)果表明，灌胃給予阿侖膦酸鈉能夠抑制骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織中p-p65/p65和p-p50/p50的表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB信號(hào)通路。此外，MAPK信號(hào)通路是生物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其亞族主要包括JNK、ERK及p38，參與介導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及發(fā)育等多種過(guò)程[16]。研究表明，MAPK信號(hào)通路對(duì)于破骨細(xì)胞的形成和活化具有重要作用，并且其也能夠通過(guò)影響NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展[17-18]。本研究結(jié)果表明，灌胃給予阿侖膦酸鈉能夠下調(diào)骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織中磷酸化JNK、ERK及p38的表達(dá)，進(jìn)而抑制MAPK信號(hào)通路活化，上述結(jié)果表明，阿侖膦酸鈉能夠抑制骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織中NF-κB和MAPK信號(hào)通路的活化。

綜上所述，阿侖膦酸鈉灌胃給予骨質(zhì)疏松大鼠，能夠通過(guò)調(diào)控NF-κB和MAPK信號(hào)通路的活化來(lái)緩解骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展。因此，本研究為阿侖膦酸鈉的抗骨質(zhì)疏松作用機(jī)制研究提供了一定的參考方向。