徐晴雯，任馮春，李 敏，朱慧志，劉向國(guó)，劉 璐

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

哮喘是一種涉及多種炎癥細(xì)胞，以慢性氣道炎癥為特征的異質(zhì)性疾病[1]，其主要病理特點(diǎn)是氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)[2]。氣道重塑是長(zhǎng)期慢性炎癥引起的氣道結(jié)構(gòu)的改變，其特征是上皮下纖維化、氣道壁增厚、平滑肌質(zhì)量增加、新生血管生成和黏液腺增多[3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-beta 1, TGF-β1)/Smad信號(hào)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與氣道重塑相關(guān)的重要機(jī)制之一[4-5]。本研究通過(guò)復(fù)制哮喘大鼠模型，觀察陽(yáng)和平喘顆粒對(duì)哮喘氣道炎癥及氣道重塑的影響并探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物與分組 SPF級(jí)SD大鼠50只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(皖)2011-0003]，飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常組、模型組、地塞米松組、陽(yáng)和平喘顆粒低劑量組、陽(yáng)和平喘顆粒高劑量組，每組10只。

1.2 藥物與試劑 卵清白蛋白(ovalbumin, OVA)(批號(hào)A5253)：美國(guó)Sigma公司；陽(yáng)和平喘顆粒(藥物組成為麻黃、五味子、葶藶子、巴戟天、熟地黃、白芥子、旋覆花、當(dāng)歸等，每包10 g，每克含生藥量2.7 g；批號(hào) 20120511)：安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心；醋酸地塞米松片(每片0.75 mg；批號(hào) 111110)：浙江仙琚制藥股份有限公司；白細(xì)胞介素4(interleukin 4, IL-4)ELISA試劑盒(批號(hào)E-30645)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6, IL-6)ELISA試劑盒(批號(hào)E-30644)：上海源葉生物科技有限公司；兔抗Smad2(批號(hào)B58028)、兔抗Smad3(批號(hào)B58031)、兔抗TGF-β1(批號(hào)G58011)：安諾倫(北京)生物科技有限公司。

1.3 儀器 魚躍503AI型超聲霧化器：江蘇魚躍集團(tuán)；霧化箱(130 cm×80 cm×75 cm)：自制；BX-Ⅸ型生物組織包埋機(jī)：孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司；EPS-300 型電泳儀：上海天能科技有限公司； BX51型光學(xué)顯微鏡：日本OLYMPUS公司；DM4000B型圖像采集系統(tǒng)：德國(guó)Leeia公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型復(fù)制 根據(jù)劉中成等[6]的方法并加以改進(jìn)復(fù)制大鼠慢性哮喘模型。致敏：模型組、地塞米松組、陽(yáng)和平喘顆粒低劑量組和陽(yáng)和平喘顆粒高劑量組在實(shí)驗(yàn)的第1天和第8天分多點(diǎn)腹腔注射致敏液(OVA 1 mg +氫氧化鋁凝膠100 mg +生理鹽水1 mL)；正常組注射等量生理鹽水。激發(fā)：實(shí)驗(yàn)第15天開始將大鼠放入霧化箱中，予以1% OVA溶液霧化，每周3次，每次30 min，連續(xù)6周；正常組予以等量生理鹽水。大鼠出現(xiàn)喘息、噴嚏、呼吸急促、煩躁不安、站立不穩(wěn)等癥狀則為激發(fā)成功。

2.2 藥物干預(yù) 將陽(yáng)和平喘顆粒加生理鹽水溶解配制成0.175 g/mL和0.7 g/mL的混懸液，將醋酸地塞米松片碾碎后加生理鹽水配制成0.008 75 mg/mL的混懸液。根據(jù)體表面積法進(jìn)行折算，于實(shí)驗(yàn)第15天開始，陽(yáng)和平喘顆粒低劑量組和陽(yáng)和平喘顆粒高劑量組每日分別予以陽(yáng)和平喘顆粒1.75、7 g/kg灌胃，其用藥量分別相當(dāng)于臨床用量的3.5倍和14倍；地塞米松組每日予以地塞米松0.087 5 mg/kg灌胃，其用藥量相當(dāng)于臨床用量的7倍。正常組和模型組每日分別給予生理鹽水10 mL/kg灌胃。各組均持續(xù)灌胃6周。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色觀察支氣管肺組織形態(tài)學(xué)改變 采用HE染色，在顯微鏡下觀察分析各組大鼠支氣管肺組織的病理改變。

2.3.2 ELISA法檢測(cè)肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中IL-4和IL-6的水平 取各組大鼠BALF，離心取上清，參照ELISA試劑盒說(shuō)明書的步驟，檢測(cè)BALF中IL-4和IL-6的水平。

2.3.3 Western blot法檢測(cè)支氣管肺組織中TGF-β1、Smad2與Smad3蛋白表達(dá) 提取大鼠左肺組織蛋白，按照試劑盒要求，按步驟完成上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉抗體，孵育一抗、二抗，徹底洗滌后經(jīng)增敏化學(xué)發(fā)光法顯色，加入底物與反應(yīng)液后，顯色5 min。用IPP軟件對(duì)圖像目的條帶進(jìn)行灰度分析，以與內(nèi)參照β-actin產(chǎn)物條帶的比值作為相對(duì)表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠支氣管肺組織形態(tài)學(xué)改變 鏡下可見正常組大鼠支氣管肺組織結(jié)構(gòu)清晰完整，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與正常組比較，模型組大鼠支氣管管腔變窄，平滑肌層及基底膜層增厚，周圍可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，陽(yáng)和平喘顆粒低劑量組、陽(yáng)和平喘顆粒高劑量組和地塞米松組大鼠支氣管管腔接近正常，平滑肌層及基底膜層增厚減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少；與陽(yáng)和平喘顆粒低劑量組比較，陽(yáng)和平喘顆粒高劑量組和地塞米松組改善更加明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠支氣管肺組織病理學(xué)改變(HE染色，10×20倍)

3.2 各組大鼠BALF中IL-4和IL-6水平比較 與正常組比較，模型組BALF中IL-4和IL-6水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)和平喘顆粒高劑量組和地塞米松組BALF中IL-4和IL-6水平均顯著降低(P<0.05)；陽(yáng)和平喘顆粒高劑量組和地塞米松組BALF中IL-4和IL-6水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠BALF中IL-4和IL-6水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與地塞米松組比較，△P<0.05；與陽(yáng)和平喘顆粒低劑量組比較，◇P<0.05

3.3 各組大鼠支氣管肺組織中TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組肺組織中TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)和平喘顆粒低劑量組、陽(yáng)和平喘顆粒高劑量組和地塞米松組肺組織中TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)；與陽(yáng)和平喘顆粒低劑量組比較，陽(yáng)和平喘顆粒高劑量組和地塞米松組肺組織中TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。見圖2、表2。

注：A.正常組；B.模型組；C.陽(yáng)和平喘顆粒低劑量組；D.陽(yáng)和平喘顆粒高劑量組；E.地塞米松組

圖2 Western blot法檢測(cè)各組大鼠肺組織中TGF-β1、

Smad2、Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)水平

4 討論

中醫(yī)將哮喘歸為“哮病”范疇，認(rèn)為該病多因痰飲留伏，結(jié)成窠臼，潛伏于內(nèi)，復(fù)感外邪，引動(dòng)內(nèi)痰，痰阻于肺，肺失宣肅，故上氣而喘，痰鳴如吼，發(fā)為哮病。哮病日久，肺脾腎三臟皆損。該病病性屬本虛標(biāo)實(shí)，故治療多以補(bǔ)腎、化痰、活血調(diào)營(yíng)為主。陽(yáng)和平喘顆粒是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院研發(fā)的院內(nèi)制劑，系胡翹武臨床經(jīng)驗(yàn)方[7]，由《椿田醫(yī)話》陽(yáng)和飲化裁而來(lái)，臨床已有數(shù)十年應(yīng)用歷史。全方組成為麻黃、五味子、葶藶子、巴戟天、熟地黃、白芥子、旋覆花、當(dāng)歸等藥。方中以麻黃宣肺平喘，利水消腫；五味子、巴戟天、熟地黃溫補(bǔ)腎陽(yáng)，納氣平喘；旋覆花、白芥子、葶藶子溫肺化飲、利氣消痰；當(dāng)歸養(yǎng)血活血，祛瘀平喘。諸藥合用，共同達(dá)到溫腎宣肺、化痰降氣、活血調(diào)營(yíng)的功效。前期臨床研究[8]表明，陽(yáng)和平喘顆?？梢愿纳品喂δ?，減輕氣道炎癥，進(jìn)而緩解患者的臨床癥狀。前期動(dòng)物研究[9-10]表明，陽(yáng)和平喘顆?？梢越档脱装Y因子表達(dá)水平，抑制杯狀細(xì)胞增生，減輕氣道黏液高分泌，從而減輕氣道炎癥及延緩氣管重構(gòu)，對(duì)哮喘大鼠有確切的治療作用。

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與地塞米松組比較，△P<0.05；與陽(yáng)和平喘顆粒低劑量組比較，◇P<0.05

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的原因，Th2細(xì)胞因子在哮喘發(fā)病中起著重要作用[11]。Th2亞群主要分泌IL-4、IL-6、IL-13等細(xì)胞因子，IL-4激活B細(xì)胞促進(jìn)分泌產(chǎn)生IgE[12]。而IL-6作為重要炎癥遞質(zhì),對(duì)急性蛋白及免疫球蛋白E生成有促進(jìn)作用[13]。另有研究證實(shí)，IL-4作為炎性細(xì)胞因子可以與TGF-β共同作用[14]，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)并沉積[15]。IL-6可誘導(dǎo)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)[16]，刺激肌纖維母細(xì)胞增殖后促進(jìn)上皮下纖維化的形成，增加氣道上皮下膠原蛋白沉積和基底膜厚度[17]。

TGF-β1/Smad信號(hào)通路參與氣道重塑過(guò)程，TGF-β1表達(dá)與氣道基底膜厚度、成纖維細(xì)胞數(shù)目呈正相關(guān)，與哮喘發(fā)作的嚴(yán)重程度也有正相關(guān)性[18]。研究表明，哮喘大鼠肺組織中TGF-β1水平升高[19]。Smad蛋白作為TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要成員，直接從細(xì)胞膜向細(xì)胞核傳遞信號(hào)，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、合成、分泌和凋亡[20]。其中Smad2、Smad3為受體調(diào)節(jié)型蛋白，直接參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，起正調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)纖維母細(xì)胞向纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)氣道肌成纖維細(xì)胞增殖。Smad2、Smad3磷酸化后刺激TGF-β1產(chǎn)生Ⅰ型膠原蛋白，并且TGF-β1使成纖維細(xì)胞分化成肌成纖維細(xì)胞[21]。肌成纖維細(xì)胞增殖，膠原沉積增多，氣道壁增厚，黏液腺增多等改變最終使傷痕組織取代了正常的肺組織，使氣體交換面積減少，最終導(dǎo)致呼吸能力下降。

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組大鼠支氣管肺組織病理改變明顯，氣管壁及周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度增加，BALF中IL-4、IL-6水平均明顯升高，提示模型組大鼠存在慢性炎癥，模型復(fù)制成功；而與模型組比較，各治療組大鼠支氣管肺組織病理改變減輕。陽(yáng)和平喘顆粒高劑量組和地塞米松組BALF中IL-4、IL-6水平較陽(yáng)和平喘顆粒低劑量組下降更明顯，陽(yáng)和平喘顆粒高劑量組與地塞米松組結(jié)果相似。結(jié)果提示陽(yáng)和平喘顆?？梢詼p輕氣道炎癥，與課題組前期研究一致。模型組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2和Smad3較正常組明顯增加；各治療組肺組織TGF-β1、Smad2和Smad3均有所下降，而陽(yáng)和平喘顆粒高劑量組和地塞米松組較陽(yáng)和平喘顆粒低劑量組下降更明顯，陽(yáng)和平喘顆粒高劑量組與地塞米松組結(jié)果相似。結(jié)果提示陽(yáng)和平喘顆?？梢詼p輕氣道重塑，這可能與其下調(diào)TGF-β1/Smad信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，本研究表明陽(yáng)和平喘顆?？梢愿纳葡瓪獾乐厮埽瑴p輕氣道炎癥，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號(hào)通路有關(guān)。