楊明，涂鳳琴，王冬梅，伊鋆，江小明*，宮智勇

1. 武漢食品化妝品檢驗所（武漢 430012）；2. 武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（武漢 430023）

隨著經(jīng)濟(jì)水平的提升，人們對蔬菜的質(zhì)量要求也不斷增加。然而，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中普遍存在的農(nóng)藥殘留問題勢必給人們的身體健康造成較大威脅[1]，引起了各國政府和國際組織對農(nóng)藥殘留問題的重視。加強農(nóng)藥管理離不開對農(nóng)藥殘留的監(jiān)督和篩查，故建立農(nóng)藥多殘留的快速篩查方法對于保障農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全具有重要意義。目前，蔬菜農(nóng)藥殘留的測定方法主要有氣相色譜（Gas chromatography，GC）法[2]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）法[3]、液相色譜（Liquid chromatography，LC）法[4]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Liquid chromatographmass spectrometery，LC-MS）法[5]等。由于檢測農(nóng)藥種類較多、基質(zhì)復(fù)雜，單一的GC和LC的定性能力較弱，很難滿足農(nóng)藥多殘留的檢測需求，而GC-MS和LC-MS均為低分辨質(zhì)譜，在分析復(fù)雜基質(zhì)樣品時也易出現(xiàn)假陽性的情況，造成結(jié)果誤判[6]。四極桿-飛行時間質(zhì)譜（Quadrupole-time of flight mass spectrometry，Q-TOF/MS）等高分辨質(zhì)譜技術(shù)因其具有高分辨率、高精度、全質(zhì)量數(shù)據(jù)采集和無需標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定性等優(yōu)勢[7]，被越來越多地應(yīng)用于農(nóng)藥篩查領(lǐng)域，為農(nóng)藥合理科學(xué)的使用提供了良好的檢測手段[8]。在前處理技術(shù)方面，傳統(tǒng)的前處理方法主要有液液萃取、固液萃取等。這些方法存在溶劑耗量大、操作較為繁瑣等缺點。QuEChERS前處理技術(shù)由于其具有操作簡單、便捷高效、溶劑用量小等特點，已被廣泛應(yīng)用于食品中農(nóng)藥殘留的分析檢測[9-10]

試驗建立了QuEChERS-高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（QuEChERS-HPLC-Q/TOF MS）快速篩查與確證蔬菜中32種農(nóng)藥殘留的分析方法。該方法僅需一次數(shù)據(jù)采集、建立譜庫，通過檢索即可同時完成目標(biāo)物的定性篩查和確證分析，縮減了前處理和檢測時間，實現(xiàn)了無標(biāo)準(zhǔn)品情況下對蔬菜樣品中32種農(nóng)藥的快速篩查和確認(rèn)，同時可對檢測到的目標(biāo)物進(jìn)行準(zhǔn)確定量，有效提升了農(nóng)藥多殘留的檢測效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

32種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品均為First Standard品牌標(biāo)準(zhǔn)品，且均購于天津阿爾塔科技有限公司，純度均≥98.0%；乙酸乙酯、丙酮、乙腈、乙酸銨（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（色譜純，美國Sigma-Aldrich公司）；十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）：上海安譜科學(xué)儀器公司；氯化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；超純水（18.2 MΩ·cm，由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得）。蔬菜樣品從市場上隨機抽取。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIEX X500R四極桿飛行時間質(zhì)譜儀（配有可用于電噴霧電離的Turbo V離子源，美國AB SCIEX公司）；LC 30A液相色譜儀（日本島津公司）；Allegra X-15R Centrifuge離心機（美國貝克曼庫爾特公司）；Vortex-Genie2渦旋振蕩器（美國Scientific Industries公司）；PM5-2000TL超聲波清洗器（普律瑪儀器公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；ME204/02電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（英國Genevac公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取適量各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)農(nóng)藥分子的溶解度和測定需要選擇甲醇、乙腈等溶劑溶解，配制質(zhì)量濃度約為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18℃保存。根據(jù)需要，移取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用空白樣品基質(zhì)提取液配制系列濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品處理

稱取5.0 g勻漿后的樣品于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋混勻，超聲提取30 min，加入3 g氯化鈉，以4 500 r/min離心5 min，上清液待凈化。取全部上清液置于含200 mg PSA、100 mg C18吸附劑的15 mL具塞離心管中，渦旋振蕩2 min，以4 500 r/min離心5 min，取5 mL上清液于試管中，于40℃旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，用1.0 mL乙腈-0.1%甲酸水（9+1，V/V）復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，供HPLC-Q-TOF/MS檢測。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）。柱溫：40℃。進(jìn)樣量：5 μL。流速：0.3 mL/min。流動相A：5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水。流動相B：5 mmol/L乙酸銨-甲醇。梯度洗脫程序：0～0.5 min，5.0% B；0.5～3.0 min，70% B；3.0～6.0 min，90.0% B；6.0～9.0 min，90.0% B；9.0～9.5 min，90.0%～5.0% B；9.5～12 min，5.0% B。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：Turbo V ESI源。掃描方式：正離子掃描。檢測方式：TOF MS-IDA-MS/MS。離子源溫度：550℃。電噴霧電壓（IS）：4 500 V。霧化氣壓力（GS1）：50 psi。輔助氣壓力（GS2）：55 psi。氣簾氣壓力（CUR）：35 psi。碰撞氣（CAD）：7 psi。TOF-MS參數(shù)為采集范圍：m/z100～1 000。去簇電壓（DP）：60 V。累計時間：0.25 s。TOF-MS/MS參數(shù)采集范圍：m/z50～1 000。碰撞能量（CE）：35 V。累計時間：0.05 s。碰撞能量波動范圍（CES）：15 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

試驗選擇Waters XBridge C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）色譜柱對32種目標(biāo)化合物進(jìn)行分離分析，并比較32種農(nóng)藥在乙腈-水與甲醇-水流動相體系中的色譜分離效果。結(jié)果表明，目標(biāo)化合物在甲醇-水流動相體系中分離度較好。進(jìn)一步考察在水相和有機相中添加不同含量的甲酸、乙酸銨對分離效果的影響。結(jié)果顯示，目標(biāo)化合物在5 mmol/L乙酸銨/0.1%甲酸水-5 mmol/L乙酸銨/甲醇流動相體系下的分離度高、保留較好且質(zhì)譜響應(yīng)高，因此采用5 mmol/L乙酸銨/ 0.1%甲酸水-5 mmol/L乙酸銨/甲醇作為流動相。

2.2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的建立

32種目標(biāo)化合物的母離子在正離子模式下的加合形式均為 [M+H]+。在優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件下，對32種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行TOF MS-IDA-MS/MS掃描。在采集一級質(zhì)譜信息的同時，當(dāng)化合物響應(yīng)值超過設(shè)定的閾值，信息相關(guān)掃描（Information Dependent Acquistion，IDA）自動觸發(fā)TOF MS/MS掃描采集目標(biāo)物的二級碎片離子信息。TOF MS-IDA-MS/MS掃描模式僅需一次數(shù)據(jù)采集，即可獲得目標(biāo)物的精確質(zhì)量母離子、保留時間等一級質(zhì)譜信息以及在三個碰撞能量（20，35和50 V）下采集并疊加的二級碎片離子信息。通過SCIEX OS軟件輸入每種農(nóng)藥分子的名稱、分子式、精確相對分子質(zhì)量、保留時間，建立32種農(nóng)藥的一級精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫，并將相應(yīng)的二級碎片離子質(zhì)譜圖導(dǎo)入譜庫，建立32種農(nóng)藥分子的二級質(zhì)譜信息庫。32種農(nóng)藥的分子式、保留時間、理論分子量和實際測得分子量等質(zhì)譜信息見表1。

表1 32種農(nóng)藥的分子式、保留時間、理論分子量、實際測得分子量和其他質(zhì)譜參數(shù)

2.3 提取試劑優(yōu)化

試驗以50 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)添加樣品對提取溶劑的種類進(jìn)行考察。根據(jù)32種農(nóng)藥化學(xué)性質(zhì)，選用乙酸乙酯、丙酮、乙腈作為提取溶劑并比較其提取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯和丙酮提取液的水分較多且顏色較深，會干擾目標(biāo)物的分析、損害色譜柱、污染質(zhì)譜離子源，且乙酸乙酯和丙酮對32種農(nóng)藥的提取平均回收率分別為62.82%和67.79%，其中乙酸乙酯中氯唑磷、噻螨酮、硫線磷、氟吡甲禾靈、蟲酰肼、肟菌酯、霜霉威、四螨嗪、炔苯酰草胺、啶酰菌胺、乙霉威、辛硫磷、嘧菌酯、噁唑菌酮、氯吡脲和氟酰脲等16種的回收率均低于59.24%，丙酮中吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲胺、噻蟲啉、呋蟲胺、殺線威、噁唑菌酮和氟酰脲等8種農(nóng)藥的回收率均低于59.19%?？傮w來看，乙腈的提取效果最好，提取液顏色較淺，32種農(nóng)藥平均回收率為88.54%，均在70%～110%之間，滿足試驗要求，因此選擇乙腈作為提取試劑。在50 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)添加樣品條件下，不同提取溶劑對蔬菜中32種農(nóng)藥的提取回收率如圖1所示。

2.4 吸附劑的選擇

蔬菜樣品基質(zhì)中含有較多的糖類、有機酸、色素、維生素、芳香物質(zhì)等，這些物質(zhì)可能會和目標(biāo)農(nóng)藥一起被提取出來，若不進(jìn)行凈化除雜，不僅會干擾目標(biāo)物的分析，而且會損害色譜柱，污染質(zhì)譜離子源。QuEChERS法經(jīng)常使用的吸附劑有PSA、C18和GCB等，可有效去除基質(zhì)中的有機酸、糖類和色素等多種組分。GCB對多菌靈和噻菌靈等平面農(nóng)藥具有很強的吸附作用，回收率低[11]，因此不使用該吸附劑。試驗研究了100 mg PSA+50 mg C18，150 mg PSA+75 mg C18，200 mg PSA+100 mg C18和250 mg PSA+125 mg C18四種不同凈化劑組合對農(nóng)藥回收的影響。結(jié)果表明（圖2）：在50 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)添加樣品條件下，200 mg PSA+100 mg C18吸附劑組合的凈化效果最好，對32種農(nóng)藥的平均回收率為88.47%，且各農(nóng)藥的回收率均在73.55%～102.67%之間。因此，選擇200 mg PSA+100 mg C18吸附劑組合作為最佳純化方案。

圖1 不同提取溶劑對蔬菜中32種農(nóng)藥的提取效率

圖2 不同吸附劑對蔬菜中32種農(nóng)藥回收率的影響

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect，ME）是指目標(biāo)分析物以外的其他組分對分析信號引起的增強或抑制現(xiàn)象[12]。試驗用不同蔬菜的空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┓謩e配制系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，通過比較標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來評價基質(zhì)效應(yīng)。計算公式：ME=基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率[13]。當(dāng)ME為0.80～1.20時，基質(zhì)效應(yīng)不明顯；當(dāng)ME＞1.20時，存在基質(zhì)增強效應(yīng)；當(dāng)ME＜0.80時，存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。結(jié)果表明：以韭菜為例，32種農(nóng)藥中21種農(nóng)藥的ME在0.80～1.20范圍內(nèi)，11種農(nóng)藥的ME在0.70～0.80之間，存在一定的基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液作校準(zhǔn)曲線來降低基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的影響。

2.6 方法學(xué)考察

用空白基質(zhì)提取液配制系列濃度的32種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，縱坐標(biāo)以峰面積（y）計，橫坐標(biāo)以質(zhì)量濃度（x）計，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，32種目標(biāo)化合物濃度與對應(yīng)的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999 0。檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別以3×和10×信噪比（S/N）計，該方法32種農(nóng)藥的檢出限在0.3～1.3 μg/kg之間，定量限在1.0～4.0 μg/kg之間。在陰性樣品中添加3個濃度水平（n=6）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以檢查該方法的回收率和精確度。32種目標(biāo)化合物的平均回收率為70.41%～103.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～11.2%，該方法回收率高、精密度高，滿足蔬菜中農(nóng)藥殘留監(jiān)測的要求。

2.7 實際樣品分析

采用所建立的方法對市售的20批次蔬菜樣品進(jìn)行分析，其中4批次樣品中檢出啶蟲脒、多菌靈、烯酰嗎啉、啶酰菌胺和嘧菌酯等5種農(nóng)藥殘留。通過檢索質(zhì)譜信息數(shù)據(jù)庫進(jìn)行定性篩查，當(dāng)可疑陽性化合物的一級精確質(zhì)量數(shù)、同位素分布、保留時間等信息與數(shù)據(jù)庫中目標(biāo)農(nóng)藥分子匹配時，再通過二級全掃描質(zhì)譜圖的匹配度進(jìn)行確證。以某一陽性樣品中檢出的啶蟲脒為例，疑似化合物的保留時間與數(shù)據(jù)庫信息一致，一級精確質(zhì)量數(shù)偏差＜5 μg/mL二級全掃描質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫中啶蟲脒二級碎片質(zhì)譜圖的鏡像比對匹配度＞80%，該化合物被確證為啶蟲脒。樣品中啶蟲脒的提取離子色譜圖、TOF-MS和TOF-MS/MS質(zhì)譜圖如圖3所示。

對篩查出的目標(biāo)物通過采用基質(zhì)匹配外表法進(jìn)行準(zhǔn)確定量，4批次陽性樣品中檢出的5種農(nóng)藥殘留，均未超過GB 2763—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定的最大殘留限量。同時，采用相對應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)對上述陽性樣品進(jìn)行了測試，驗證了該方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果與該方法測定的結(jié)果一致。具體結(jié)果見表2。

圖3 某陽性樣品中啶蟲脒的提取離子色譜圖、TOF-MS和TOF-MS/MS質(zhì)譜圖

表2 實際陽性樣品檢測結(jié)果

3 結(jié)論

試驗以QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜檢測技術(shù)，建立了快速篩查蔬菜中32種農(nóng)藥殘留的分析方法。利用該方法建立的一級精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫和二級全掃描質(zhì)譜信息庫，無需標(biāo)準(zhǔn)品即可實現(xiàn)蔬菜中32種農(nóng)藥殘留的快速篩選和準(zhǔn)確測定。實際樣品檢驗中進(jìn)一步證明該方法簡便、快速、高效、準(zhǔn)確可靠，可用于蔬菜質(zhì)量安全風(fēng)險評估中多種類農(nóng)藥殘留的快速篩查分析，同時也對蔬菜農(nóng)藥殘留的監(jiān)測具有較高的實用價值。