張寶翠，朱玉昌,2，王應(yīng)玲，陳莉莉，姜 寧,2*

(1.湖北民族大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室(湖北民族大學(xué))，湖北 恩施 445000；3.湖北省地質(zhì)局第二地質(zhì)大隊，湖北 恩施 445000)

榆黃蘑(Pleurotuscitrinopileatus)又稱為金頂側(cè)耳、玉皇蘑，屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，是珍貴的藥食同源經(jīng)濟菌之一[1].具有多種生理藥理活性物質(zhì)[2-3]，其中多糖是主要的活性成分之一[4]，具有免疫調(diào)節(jié)[5]、抗氧化性[6]、抗炎[7]等生物活性.

藥食同源真菌人工馴化有著悠久的歷史，固體基質(zhì)人工栽培與液體深層發(fā)酵相輔相成.采用深層發(fā)酵培養(yǎng)由于占地小、成本低廉、生產(chǎn)周期短且菌齡可保持高度一致，所以采用深層發(fā)酵獲得藥食同源真菌菌絲體，并進一步提取有效活性成分、對活性成分進行深層次研究已成為當(dāng)今的熱點[8-10].無論子實體還是菌絲體，食用菌多糖一般采用水浴醇沉法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、蛋白酶輔助提取法等，各種提取方法各有優(yōu)勢.提高多糖得率除優(yōu)化提取外，還可采用誘導(dǎo)菌絲體生長的方法[11].榆黃蘑多糖的提取工藝研究大多限于子實體，對榆黃蘑菌絲體多糖的提取及功能研究較少.本研究以榆黃蘑菌絲體為研究對象，對菌絲體多糖提取的工藝進行優(yōu)化，為榆黃蘑的深層次開發(fā)利用提供試驗依據(jù).

表1 正交試驗因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榆黃蘑(Pleurotuscitrinopileatus)菌種購自江蘇省江都天達食用菌研究所，由生物資源保護與利用湖北省重點實驗室(湖北民族大學(xué))保存.蒽酮、VB1、KH2PO4，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，武漢市中天化工有限責(zé)任公司；其余試劑均為分析純.

1.2 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基：馬鈴薯 20%，葡萄糖2%，磷酸二氫鉀0.1%，瓊脂2%，pH值自然，100 mL蒸餾水.

種子液培養(yǎng)基：菌種活化培養(yǎng)基不加瓊脂，分裝于250 mL錐形瓶，裝液量為100 mL，無菌封口膜封口，用于制備深層發(fā)酵種子液.

深層發(fā)酵培養(yǎng)基：1%葡萄糖，3%黃豆粉，3%可溶性淀粉，0.1%磷酸二氫鉀，0.01%維生素B1，pH值自然，100 mL蒸餾水.

1.3 儀器與設(shè)備

BSD-YX2200智能精密搖床，上海博訊實業(yè)有限公司；YGF300/50L發(fā)酵罐,上海洋格生物工程設(shè)備有限公司；TU-1810型紫外-可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司.

1.4 試驗方法

1.4.1 種子液及菌絲體的制備 將凍存菌種接入平板活化培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)10 d后，無菌條件下，用直徑0.5 cm打孔器打孔菌種平板，接入液體種子液培養(yǎng)基中，150 r/min 26 ℃震蕩培養(yǎng)5～7 d.再將種子液接種于發(fā)酵罐中發(fā)酵，溫度為26 ℃，接種量為10%，DO 40%～60%，150 r/min培養(yǎng)7 d.將培養(yǎng)好的菌絲體用4層紗布清洗過濾，真空冷凍干燥，粉碎過60目篩，備用.

1.4.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用蒽酮-硫酸比色法[12]測多糖含量.以葡萄糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.4.4 單因素試驗 ①液固比對榆黃蘑菌絲體多糖得率的影響.稱取榆黃蘑菌絲體粉末，分別按液固比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1(mL/g)加入蒸餾水70 ℃浸提2 h，3 500 r/min離心20 min，取上清.按1.4.3操作測多糖含量，計算得率.②提取時間對榆黃蘑菌絲體多糖得率的影響.稱取榆黃蘑菌絲體粉末，按液固比15∶1(mL/g)加入蒸餾水，70 ℃分別浸提1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，3 500 r/min離心20 min，取上清.按1.4.3操作測多糖含量，計算得率.③提取溫度對榆黃蘑菌絲體多糖得率的影響.稱取榆黃蘑菌絲體粉末，按液固比15∶1(mL/g)加入蒸餾水，分別在40、50、60、70、80、90 ℃浸提2 h，3 500 r/min離心20 min，取上清.按1.4.3操作測多糖含量，計算得率.④提取次數(shù)對榆黃蘑菌絲體多糖得率的影響.稱取榆黃蘑菌絲體粉末，按液固比15∶1(mL/g)加入蒸餾水70 ℃浸提2 h，3 500 r/min離心20 min，取上清.殘渣按上述方法再分別提取1、2、3、4次，合并提取的上清液，按1.4.3操作測多糖含量計算得率.

1.4.5 正交試驗及驗證 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用L9(34)正交表進行正交試驗，因素水平設(shè)計見表1.

根據(jù)正交試驗結(jié)合方差的結(jié)果確定提取最優(yōu)組合，設(shè)置3個平行組，測定多糖得率，驗證結(jié)果可靠性.用SPSS和origin 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)多重比較采用Tukey法.

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

葡萄糖糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度與吸光度的關(guān)系，如圖1.葡萄糖在0～80 μg/mL的范圍內(nèi)，R2=0.999 5，回歸方程為y=6.908 4x-0.004 3(y為吸光度，x為葡萄糖質(zhì)量濃度).

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Glucose

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 液固比對榆黃蘑菌絲體多糖得率的影響 液固比對榆黃蘑菌絲體多糖得率有影響(圖2)，液固比5∶1(g/mL)和10∶1(g/mL)時，多糖得率無顯著性差異.但在10∶1(g/mL)升至20∶1(g/mL)時，菌絲體多糖得率不斷提高.當(dāng)液固比大于20∶1(g/mL)后，菌絲體多糖得率開始下降.這是因為隨著溶劑用量的增加，多糖有效溶出增大，但當(dāng)液固比達到一定程度時，多糖已基本溶出，不會繼續(xù)增大，且隨著提取液體積的增大，使提取損耗加大反而使得率有所下降.根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇液固比15∶1、20∶1、25∶1(g/mL)3個水平進行正交試驗研究.

2.2.2 提取時間對榆黃蘑菌絲體多糖得率的影響 隨著時間的增加，菌絲體粗多糖得率不斷升高，在2.5 h后時得率增加不明顯，反而有減少趨勢，這說明在一定范圍內(nèi)增加浸提時間，多糖的溶出度增大，但是到達一定程度時，物料中多糖與溶劑中多糖含量已達到穩(wěn)定狀態(tài)，同時雜質(zhì)也可能溶出，致使多糖得率下降(圖3).因此，選擇2.0、2.5、3.0 h三個水平進行正交試驗研究.

2.2.3 提取溫度對榆黃蘑菌絲體多糖得率的影響 提取溫度對榆黃蘑菌絲體多糖得率的影響結(jié)果如圖4所示，在40～60 ℃時，由于溫度較低，分子運動速率緩慢，溶質(zhì)溶出不充分，多糖得率變化不明顯.在60～90 ℃時菌絲體多糖得率不斷升高，因為溫度的升高，細胞分子運動速率提高，使得多糖擴散、溶出速率提升，因此多糖的得率提高.但當(dāng)溫度超過80 ℃后，多糖得率不再顯著增加，這是因為溫度過高會使多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞.多糖得率在80 ℃與90 ℃條件下無顯著性差異，因此，選擇70、80、90 ℃三個水平進行正交試驗研究.

2.2.4 提取次數(shù)對榆黃蘑菌絲體多糖得率的影響 提取次數(shù)會影響榆黃蘑菌絲體多糖得率(圖5)，提取次數(shù)的增加會使多糖得率不斷升高，但當(dāng)浸提次數(shù)超過4次時，多糖得率反而有所下降.這說明浸提3次時，多糖已能夠充分溶出，浸提次數(shù)過多，反而使得其他水溶性物質(zhì)的溶出，也會影響多糖得率.因此，選擇前3個水平進行正交試驗研究.

2.3 正交試驗與驗證結(jié)果分析

根據(jù)正交試驗結(jié)果(表2)可知，影響榆黃蘑菌絲體多糖提取的主次因素為A>C>D>B，最優(yōu)組合是A3B3C3D3，即提取3次、液固比25∶1(mL/g)、提取溫度90 ℃、提取時間3 h.根據(jù)方差分析結(jié)果(表3)可知，提取次數(shù)與提取溫度對多糖得率有極顯著的影響(P<0.01)，提取時間對多糖得率有顯著的影響(P<0.05)，液固比對多糖得率無顯著影響.根據(jù)F值大小得出影響菌絲體多糖主次因素為A>C>D>B，這與極差分析結(jié)果相同.由于極差分析，B3與B1相差僅0.56，考慮降低能耗，節(jié)約成本，液固比確定為B1，即最優(yōu)條件為A3B1C3D3.

表2 正交試驗結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal test

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Tab.3 Analysis of variance of results of orthogonal test

注：*表示P<0.05；**表示P<0.01.

根據(jù)最優(yōu)結(jié)果A3B1C3D3，即提取3次、液固比15∶1(mL/g)、提取溫度90 ℃、提取時間3 h，對榆黃蘑菌絲體多糖提取進行驗證試驗，多糖提取得率達4.55%，結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可靠.

3 討論

水提醇沉法已廣泛應(yīng)用于各類真菌多糖的提取[12-13]，衣銘慧等[14]與石堃等[15]均優(yōu)化了榆黃蘑子實體多糖提取工藝，雖然得率達到8.0%以上，但由于栽培子實體工藝要求高、占地大、周期長等導(dǎo)致生產(chǎn)成本顯著高于菌絲體生產(chǎn)，所以多糖的生產(chǎn)成本依然高于本實驗.蔡德華等[16]曾采用超聲輔助提取法優(yōu)化了榆黃蘑新鮮菌絲體多糖提取工藝，得到的優(yōu)化工藝：超聲波破壁時間12 min，提取時間4 h，提取溫度70 ℃，菌絲密度250 mg/mL(鮮重)，得率為2.99%.與上述研究相比，本研究采用的是烘干后的菌絲，在工業(yè)化生產(chǎn)上更具有指導(dǎo)意義，雖然提取溫度較高，但減少了設(shè)備投入，縮短了提取時間，提高了得率.

本研究對榆黃蘑菌絲體多糖的提取工藝進行了研究，優(yōu)化了水浴提取的工藝條件.確定了榆黃蘑菌絲體多糖的最佳提取工藝，為榆黃蘑的進一步開發(fā)利用提供了實驗依據(jù).