徐 杰，王寶成，姜文月*，王美慧，楊明爽，蘇小紅，李芯茹

(1.吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130012；2.通藥制藥集團(tuán)股份有限公司，吉林 通化 134001)

目前類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)動(dòng)物模型有很多，如佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、卵蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、多聚糖蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型等。其中，佐劑性關(guān)節(jié)炎模型與人RA在發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)、病理、免疫等方面有著相似或相近的特點(diǎn)，且弗氏完全佐劑的操作簡(jiǎn)便易行，造模周期較短，重復(fù)性好，可同時(shí)獲得大量模型動(dòng)物，對(duì)RA的基礎(chǔ)研究十分適宜。

本研究采用佐劑性關(guān)節(jié)炎模型作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，通過(guò)外界施以“風(fēng)寒濕”和“風(fēng)濕熱”的致病因素制備風(fēng)寒濕痹與風(fēng)濕熱痹兩類病證結(jié)合動(dòng)物模型，觀察活絡(luò)止痛丸對(duì)風(fēng)寒濕痹與風(fēng)濕熱痹模型大鼠的治療作用，并探討其治療風(fēng)濕痹癥的作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物

Wistar大鼠，雄性，體重180～220 g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證為SCXK(吉)-2018-0007。

1.2 藥物與試劑

活絡(luò)止痛丸(批號(hào)：180501)由通藥制藥集團(tuán)股份有限公司提供；萬(wàn)通筋骨片(批號(hào)：02171213K)購(gòu)自通化萬(wàn)通藥業(yè)股份有限公司；弗氏完全佐劑(批號(hào)：SLBR3897V)購(gòu)自Sigma公司；大鼠白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20190301)、大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20190301)、大鼠前列腺素E2(PGE2)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20190301)、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒(批號(hào)：20190301)、丙二醛(MDA)測(cè)試盒(批號(hào)：20190227)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；氯化鈉注射液(批號(hào)：1805090401)購(gòu)自吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司。

1.3 儀器

FS40-8B1電風(fēng)扇(美的環(huán)境電器制造有限公司)；FS40-301電風(fēng)扇(佛山市順德區(qū)晟亞電器有限公司)；DK-98-ⅡA水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；DHG-9245A鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；Spectra Max Plus 384型酶標(biāo)儀(美國(guó)美谷分子儀器有限公司)；JY2003電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；TDZ5-WS臺(tái)式低速多管自動(dòng)平衡離心機(jī)(長(zhǎng)沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司)。

2 方法

2.1 給藥劑量

按照活絡(luò)止痛丸產(chǎn)品說(shuō)明書用法與用量要求，口服，一次4 g，一日3次。每人按平均60 kg計(jì)算為0.2 g/kg/d/人，折算大鼠給藥劑量為1.25 g/kg，故設(shè)立低劑量(1.25 g/kg)和高劑量(2.5 g/kg)。

按照萬(wàn)通筋骨片(陽(yáng)性藥)產(chǎn)品說(shuō)明書用法與用量要求，口服，每片0.28 g，一次2片，一日2～3次。每人按平均60 kg計(jì)，每天口服6片算為0.028 g/kg/d/人，折算大鼠給藥劑量為0.175 g/kg。

2.2 建立風(fēng)濕痹證模型[1-7]

風(fēng)寒濕痹模型：Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、風(fēng)寒濕痹模型組、萬(wàn)通筋骨片、活絡(luò)止痛丸高劑量與低劑量組，共5組，每組10只。除空白組外，其余各組大鼠在造模的第1天，每只大鼠注射弗氏完全佐劑0.1 mL于左后足跖皮內(nèi)1次，造模7 d后再注射0.1 mL加強(qiáng)免疫，建立佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，并將大鼠置于5～7 ℃冷水中，水深2 cm，伴以3檔風(fēng)力，每日1次，每次20 min，連續(xù)14 d。自造模第15天起，各給藥組大鼠灌胃給藥，空白組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)21 d。

風(fēng)濕熱痹模型：Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、風(fēng)濕熱痹模型組、萬(wàn)通筋骨片、活絡(luò)止痛丸高劑量與低劑量組，共5組，每組10只。除空白組外，其余各組大鼠在造模的第1天，每只大鼠注射弗氏完全佐劑0.1 mL于左后足跖皮內(nèi)1次，造模7 d后再注射0.1 mL加強(qiáng)免疫，建立佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，并將大鼠置于36～38 ℃熱水中，水深2 cm，伴以3檔風(fēng)力，同時(shí)給予37 ℃水浴恒溫?zé)嵴羝?，每?次，每次20 min，連續(xù)14 d。自造模第15天起，各給藥組大鼠灌胃給藥，空白組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)21 d。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.3.1 一般狀況觀察 觀察各組大鼠體質(zhì)量、毛色、活動(dòng)等情況。

2.3.2 足腫脹度 第35天末次給藥后測(cè)定各組大鼠致炎足的足跖容積。

2.3.3 關(guān)節(jié)炎指數(shù) 關(guān)節(jié)炎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：后足無(wú)關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)計(jì)0分；后足1～2個(gè)關(guān)節(jié)發(fā)紅，軟組織腫脹計(jì)1分；后足3～4個(gè)關(guān)節(jié)發(fā)紅，軟組織腫脹計(jì)2分；后足5個(gè)或更多關(guān)節(jié)發(fā)紅，軟組織腫脹計(jì)3分；后足嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎計(jì)4分。

2.3.4 大鼠血清TNF-α、IL-1β、PGE2及SOD、MDA水平 第35天末次給藥后1 h，腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，分離血清。用試劑盒測(cè)定大鼠血清 TNF-α、IL-1β、PGE2、SOD、MDA的水平，具體操作按說(shuō)明書步驟進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究利用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用雙側(cè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 一般狀況觀察

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，空白組大鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光滑有光澤，活動(dòng)自如，體重增加較快；風(fēng)寒濕痹和風(fēng)濕熱痹模型組大鼠右后足跖致炎后腫脹明顯，毛色泛黃而無(wú)光澤，活動(dòng)減少，精神不振，個(gè)別大鼠右后肢足跖及踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)潰爛、脫毛現(xiàn)象，體重增長(zhǎng)緩慢；給予萬(wàn)通筋骨片及活絡(luò)止痛丸干預(yù)后，上述癥狀均明顯緩解，但模型組基本無(wú)變化。

3.2 足腫脹度

與空白組相比，風(fēng)寒濕痹模型組致炎后足跖容積顯著升高(P<0.001)；與風(fēng)寒濕痹模型相比，活絡(luò)止痛丸高劑量組與萬(wàn)通筋骨片組顯著降低足跖容積(P<0.01，P<0.05)，活絡(luò)止痛丸低劑量組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

與空白組相比，風(fēng)濕熱痹模型組致炎后足跖容積顯著升高(P<0.001)；與風(fēng)濕熱痹組模型相比，活絡(luò)止痛丸高劑量組與萬(wàn)通筋骨片組顯著降低足跖容積(P<0.05，P<0.05)，活絡(luò)止痛丸低劑量組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

組別給藥劑量(g/kg)足腫脹度(mm)風(fēng)寒濕痹模型風(fēng)濕熱痹模型空白組-4.578±0.3084.578±0.308模型組-6.467±0.562???6.471±0.430???萬(wàn)通筋骨片組0.185.887±0.382#???5.865±0.338#???活絡(luò)止痛丸低劑量組1.256.567±0.356???6.691±0.539???活絡(luò)止痛丸高劑量組2.505.854±0.256##???5.838±0.293#???

注：與空白組比較：***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05；與模型組比較：###P<0.001，##P<0.01，#P<0.05。

3.3 關(guān)節(jié)炎指數(shù)

與空白組相比，風(fēng)寒濕痹模型組致炎后關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分顯著升高(P<0.001)；與風(fēng)寒濕痹模型相比，活絡(luò)止痛丸高劑量組與萬(wàn)通筋骨片組顯著降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分(P<0.05，P<0.05)，活絡(luò)止痛丸低劑量組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

與空白組相比，風(fēng)濕熱痹模型組致炎后關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分顯著升高(P<0.001)；與風(fēng)濕熱痹模型組相比，活絡(luò)止痛丸高劑量組與萬(wàn)通筋骨片組顯著降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分(P<0.001，P<0.01)，活絡(luò)止痛丸低劑量組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

組別給藥劑量(g/kg)關(guān)節(jié)炎指數(shù)風(fēng)寒濕痹模型風(fēng)濕熱痹模型空白組-00模型組-2.600±0.866???2.900±0.972???萬(wàn)通筋骨片組0.181.778±0.744#???1.900±0.333##???活絡(luò)止痛丸低劑量組1.252.100±0.333???2.500±0.726???活絡(luò)止痛丸高劑量組2.501.875±0.000#???1.400±0.500###???

注：與空白組比較：***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05；與模型組比較：###P<0.001，##P<0.01，#P<0.05。

3.4 大鼠血清TNF-α、IL-1β、PGE2及SOD、MDA水平

3.4.1 細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β TNF-α：與空白組相比，風(fēng)寒濕痹模型組TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，與風(fēng)寒濕痹模型組相比，萬(wàn)通筋骨片、活絡(luò)止痛丸低劑量與高劑量組均顯著降低TNF-α水平(P<0.05，P<0.01，P<0.05)；與空白組相比，風(fēng)濕熱痹模型組TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，與風(fēng)濕熱痹模型組相比，萬(wàn)通筋骨片、活絡(luò)止痛丸低劑量與高劑量組均顯著降低TNF-α水平(P<0.05，P<0.01，P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

IL-1β：與空白組相比，風(fēng)寒濕痹模型組IL-1β水平顯著升高(P<0.01)，與風(fēng)寒濕痹模型組相比，萬(wàn)通筋骨片、活絡(luò)止痛丸低劑量與高劑量組均顯著降低IL-1β水平(P<0.05，P<0.01，P<0.05)；與空白組相比，模型風(fēng)濕熱痹組IL-1β水平顯著升高(P<0.05)，與模型風(fēng)濕熱痹組相比，萬(wàn)通筋骨片與活絡(luò)止痛丸高劑量組均顯著降低IL-1β水平(P<0.05，P<0.05)，活絡(luò)止痛丸低劑量組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

組別給藥劑量(g/kg)TNF-α(ng/L)風(fēng)寒濕痹模型風(fēng)濕熱痹模型IL-1β(ng/L)風(fēng)寒濕痹模型風(fēng)濕熱痹模型空白組-155.520±30.806155.520±30.80618.343±5.19818.343±5.198模型組-258.007±102.397?225.613±61.889?25.861±5.357??26.162±7.680?萬(wàn)通筋骨片組0.18159.766±44.005#162.709±34.756#18.397±5.953#18.367±3.312#活絡(luò)止痛丸低劑量組1.25147.470±38.960##125.621±56.151##18.073±4.329##21.610±7.101活絡(luò)止痛丸高劑量組2.50158.906±35.065#145.788±45.081#19.736±4.987#18.762±3.452#

注：與空白組比較：***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05；與模型組比較：###P<0.001，##P<0.01，#P<0.05。

3.4.2 PGE2 與空白組相比，風(fēng)寒濕痹模型組PGE2水平顯著升高(P<0.05)；與風(fēng)寒濕痹模型組相比，萬(wàn)通筋骨片、活絡(luò)止痛丸低劑量與高劑量組均顯著降低PGE2水平(P<0.05，P<0.01，P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

與空白組相比，風(fēng)濕熱痹模型組PGE2水平顯著升高(P<0.05)；與風(fēng)濕熱痹模型組相比，萬(wàn)通筋骨片、活絡(luò)止痛丸低劑量與高劑量組均顯著降低PGE2水平(P<0.05，P<0.01，P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

3.4.3 SOD和MDA SOD：與空白組相比，風(fēng)寒濕痹模型組SOD活力顯著降低(P<0.01)，與風(fēng)寒濕痹模型組相比，萬(wàn)通筋骨片與活絡(luò)止痛丸高劑量組顯著升高SOD活力(P<0.05，P<0.05)，低劑量無(wú)顯著性差異(P>0.05)；與空白組相比，風(fēng)濕熱痹模型組SOD活力顯著降低(P<0.001)，與風(fēng)濕熱痹模型組相比，萬(wàn)通筋骨片、活絡(luò)止痛丸低劑量與高劑量組均顯著升高SOD活力(P<0.01，P<0.05，P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

MDA：與空白組相比，風(fēng)寒濕痹模型組MDA水平顯著升高(P<0.001)，與風(fēng)寒濕痹模型組相比，萬(wàn)通筋骨片、活絡(luò)止痛丸低劑量與高劑量組均顯著降低MDA水平(P<0.001，P<0.001，P<0.001)；與空白組相比，風(fēng)濕熱痹模型組MDA水平顯著升高(P<0.001)，與風(fēng)濕熱痹模型組相比，萬(wàn)通筋骨片、活絡(luò)止痛丸低劑量與高劑量組均顯著降低MDA水平(P<0.05，P<0.001，P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

組別給藥劑量(g/kg)PGE2(ng/L)風(fēng)寒濕痹模型風(fēng)濕熱痹模型空白組-193.020±38.369193.020±38.369模型組-240.678±25.144?242.463±32.062?萬(wàn)通筋骨片組0.18195.801±37.863#200.215±28.561#活絡(luò)止痛丸低劑量組1.25190.730±33.718##191.571±22.377##活絡(luò)止痛丸高劑量組2.50198.518±32.982#186.495±32.609##

注：與空白組比較：***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05；與模型組比較：###P<0.001，##P<0.01，#P<0.05。

組別給藥劑量(g/kg)SOD(U/mL)風(fēng)寒濕痹模型風(fēng)濕熱痹模型MDA(nmol/mL)風(fēng)寒濕痹模型風(fēng)濕熱痹模型空白組-164.342±6.917164.342±6.9173.689±0.3643.689±0.364模型組-144.450±15.191??141.790±9.245???12.035±0.908???11.371±1.531???萬(wàn)通筋骨片組0.18158.300±8.309#166.183±13.441##6.768±1.285###???8.851±2.565#???活絡(luò)止痛丸低劑量組1.25156.925±13.787153.992±11.665#4.849±1.954###5.540±1.705###??活絡(luò)止痛丸高劑量組2.50159.573±8.438#158.140±11.233##6.698±1.966###???7.390±2.261##???

注：與空白組比較：***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05；與模型組比較：###P<0.001，##P<0.01，#P<0.05。

4 討論

本研究采用弗氏完全佐劑誘導(dǎo)佐劑性關(guān)節(jié)炎，通過(guò)外界施以“風(fēng)寒濕”和“風(fēng)濕熱”的致病因素制備風(fēng)寒濕痹與風(fēng)濕熱痹兩類病證結(jié)合動(dòng)物模型，觀察活絡(luò)止痛丸對(duì)風(fēng)寒濕痹與風(fēng)濕熱痹模型大鼠的治療作用，并探討其治療風(fēng)濕痹證的作用機(jī)制。試驗(yàn)結(jié)果表明，與風(fēng)寒濕痹及風(fēng)濕熱痹模型組相比，活絡(luò)止痛丸可顯著降低足腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、血清IL-1β、TNF-α、PGE2、MDA水平，升高血清SOD水平，對(duì)風(fēng)濕痹證模型大鼠具有治療作用，為臨床合理使用提供了理論依據(jù)。