陳光輝 王孟文 李 焱 劉 東 廖 凌**

(1.新疆大學生命科學與技術(shù)學院，新疆烏魯木齊 830046； 2.喀什海關(guān)技術(shù)中心， 新疆喀什 844000； 3.喀什大學生命與地理科學學院，新疆喀什 844000)

蚊類是重要的醫(yī)學昆蟲(竇洪舉，1987；王創(chuàng)新，2013)，有些種類是嚴重疾病的傳播媒介(劉建利，2015；尹授欽，2016)，嚴重危害人類健康(陸寶麟, 2000；張光學, 2008；邊長玲, 2009；Wangetal., 2012)。口岸蚊類監(jiān)測表明，我國口岸蚊類以按蚊屬、庫蚊屬、伊蚊屬為主(聶維忠，2011；Wangetal., 2012；方義亮，2013；郭玉燕等，2017)。目前，需要重點防治的蚊類有中華按蚊Anophelessinensis、雷氏按蚊Anopheleslesteri、大劣按蚊Anophelesdirus、微小按蚊Anophelesminimus、淡色庫蚊Culexpipienspallens尖音庫蚊淡色亞種、致倦庫蚊Culexpipiensquinquefasciatus、三帶喙庫蚊Culextritaeniorhynchus、白紋伊蚊Aedesalbopictus、埃及伊蚊Aedesaegypti等(陸寶麟，2001；邵柏，2002；周健明，2013；趙宣等，2017)。

由于蚊類的醫(yī)學媒介重要性，對其快速準確鑒定成為口岸流行性傳染病防控監(jiān)測與控制的基礎(chǔ)，也是疾病預防與控制、國境衛(wèi)生檢疫的核心環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法雖然具有研究方便、直觀等特點(梁帆等，2017)，但是受技術(shù)人員的經(jīng)驗積累、專業(yè)水平和主觀認識、標本完整性與發(fā)育階段等因素限制(吳宏華，2013)，而且蚊科存在大量復合組(體)、種團和近緣種，如赫坎按蚊復合種團(Anopheleshyrcanuscomplex)、尖音庫蚊復合種團(CulexpipiensComplex)、大劣按蚊種團(Anophelesdiruscomplex)等，種團內(nèi)的近緣種形態(tài)差異甚小，對于形態(tài)較難區(qū)分的復合體成員種(或隱種)，僅使用傳統(tǒng)的形態(tài)分類方法鑒定較為困難(陸寶麟，1999；周華云，2004)。這都使得傳統(tǒng)媒介蚊種鑒定方法鑒定周期長、鑒定效率低等問題長期存在，不利于口岸蚊蟲的高效防控；因此，需要發(fā)展更加安全、快速、準確、靈敏的檢疫鑒定技術(shù)。

分子鑒定方法能夠?qū)崿F(xiàn)媒介生物的快速鑒定，該方法是以核酸堿基排列順序為基礎(chǔ)而建立的(高琪，2005)，即將分子生物學技術(shù)如RAPD、PCR-SSCP和AFLP等，結(jié)合多種分子標識如微衛(wèi)星、線粒體基因(COI、COII、16SRNA等)和核糖體序列(ITS)等，實現(xiàn)蚊類的分子系統(tǒng)學鑒定(陸寶麟等，1999；彭淑瓊等，2010；付文博等，2013)；該方法以DNA序列為研究對象，具有準確度高、簡便快速、且不受發(fā)育階段的影響等優(yōu)點(張媛等，2011；周青松等，2013；宋南等，2013；陳光輝等,2017)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各物種的分類學鑒定(肖金花等，2004；韋健紅等，2010；陳光輝等，2018)。目前在蚊類線粒體基因中，常選用COI、COII、16SRNA鑒定物種(郭玉燕等，2017)；在核糖體基因中，常選用ITS1、ITS2 和18S rDNA 鑒定物種。例如，多數(shù)物種的COI序列的種內(nèi)遺傳距離大多小于2%，而種間遺傳差異相對較高(Folmeretal., 1994；Hebertetal., 2003b； Wardetal., 2005; Hajibabaeietal.，2006；張媛，2011)，能夠廣泛用于動物種及種群研究。由于ITS1、ITS2等基因選擇壓力小，變異較大，種內(nèi)遺傳差異相對其他基因較高，適合物種及其種群的研究(黃華平等，2006)；ITS1基因序列種內(nèi)遺傳距離有時會超過3%，也可以有效區(qū)別物種(Robertetal., 2013)。

蚊類分子系統(tǒng)學方面的研究主要集中于所在屬、種及種內(nèi)復合組的研究，并且多集中于mtDNA-COI、ITS2基因，對ITS1、Cytb等基因的研究較少。本研究通過傳統(tǒng)分類學確定未知蚊類大致類群，檢索或設(shè)計引物，擴增出蚊蟲的ITS1、ITS2、Cytb、COI基因序列，獲得的相關(guān)分子數(shù)據(jù)作為形態(tài)學特征的補充，實現(xiàn)目標蚊種的快速鑒定；同時，通過已知種類通用引物來獲得未知基因序列，豐富了蚊類ITS1、ITS2、COI核酸數(shù)據(jù)庫，為蚊蟲快速鑒定、監(jiān)測預警及后續(xù)防控提供理論基礎(chǔ)。

表1 樣品信息Tab.1 Sample information

1 材料與方法

1.1 標本采集

蚊類的采集：2017和2018年8月中旬前后，在黃昏至凌晨蚊類出沒期，在喀什市陽光小區(qū)河邊和小亞郎水庫邊蚊蟲較多的水邊架設(shè)蚊蟲采集網(wǎng)采集樣品；部分蚊類標本系喀什海關(guān)口岸送檢樣品，樣品獲得信息如表1所示。依據(jù)文獻(陸寶麟，1997；宋明昌，2004)初步確定為雙翅目蚊科，形態(tài)鑒定結(jié)果由通過蚊蟲能力驗證的專家進行核實；能力驗證樣本為未知蟲足，將蚊蟲樣本整理后保存于含有99%酒精的離心管中，并放置于冰箱4 ℃冷藏保存，做為DNA提取材料。

1.2 基因組 DNA 提取和PCR 擴增

1.2.1基因組 DNA 的提取: DNA提取參照鄒志文等(2011)Chelex改進方法；對單只蚊蟲樣品用雙蒸水清洗干凈(清洗2次，期間渦旋震蕩取出雜質(zhì))，將清洗干凈的樣品置于潔凈濾紙上干燥；挑取單頭樣品置于1.5 mL的離心管中，用滅菌玻璃研磨棒充分研磨；加滅菌雙蒸水0.5 mL，渦旋混勻，冰箱-20 ℃冷卻10 min后，12 000 r/min離心5 min，棄上清，重復2～3次；沉淀中加入150 μL懸浮好的5%的Chelex-100溶液，56 ℃水浴2 h；渦旋5～10 s，置100 ℃加熱10 min；取出后渦旋溶液5～10 s，10 000 r/min離心5 min，上清液即可作為PCR反應(yīng)的DNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆?Walshetal.，2011)。此法提取的DNA無法電泳檢測(周月琴等，2003)。

1.2.2基因片段PCR 擴增: 引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成，具體引物序列及參考文獻如表2所示。擴增體系總體積為25 μL，包括1.5 U Taq酶，0.25 mmol/L dNTP，1×反應(yīng)緩沖液，2.0 mmol/L Mg2+，上下游引物各為通用引物0.3 μmol/L，DNA 模板50 ng。反應(yīng)程序為：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性 45 s，55 ℃或58 ℃(ITS1)退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，循環(huán) 40次，循環(huán)結(jié)束后 72 ℃延伸 7 min。PCR產(chǎn)物直接送到安徽通用生物技術(shù)有限公司進行測序(雙脫氧法)。

表2 PCR 擴增引物設(shè)計及參考文獻Tab.2 PCR amplification primers and references

1.3 序列數(shù)據(jù)處理及分子系統(tǒng)樹構(gòu)建

測序獲得的基因序列用 DNA star Package 中的Editseq軟件進行正反鏈拼接匹配校正。在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上運行 BLAST程序進行序列同源性比較，確定所獲得的序列是否是昆蟲的ITS1、ITS2、Cytb、COI基因序列。根據(jù)相似度和種內(nèi)遺傳距離對樣品進行分子鑒定。結(jié)合從GenBank 中比對的與所獲得的ITS1、ITS2、Cytb、COI序列同源性較高的蚊類的相關(guān)序列，用ClustalX1.83軟件比對，非保守區(qū)域去除。用分子進化遺傳分析軟件MEGA6.0(Kumaretal., 2004；金倩等，2013)分析各物種間DNA序列的差異，統(tǒng)計分析堿基含量和使用頻率?；?Kimura-2-Parameter模型，用鄰近法(NJ, Neighbour-Jioning)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，1 000次循環(huán)估計系統(tǒng)樹中節(jié)點的自舉置信水平(Bootstrap confidence level，BCL)。

2 結(jié)果

2.1 分子鑒定

測序獲得了14個蚊蟲樣品的部分ITS1、ITS2、Cytb、COI基因的部分序列，依據(jù)表3中在NCBI數(shù)據(jù)庫中查閱的相關(guān)序列的最高得分、覆蓋度、相似度、可能物種排序的等信息進行鑒定。覆蓋度較低，且序列相似度低于種內(nèi)遺傳距離的補數(shù)時，確定為新的條形碼序列，即數(shù)據(jù)庫中未檢索到相關(guān)高度相似序列，核酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)序列相似度較低，確定為該蚊蟲樣品的新序列。本文獲得的蚊蟲核酸序列39條，其中ITS1 基因10條、ITS2基因9條、Cytb基因10條、COI基因10條；由于實驗操作水平有限和樣品有限有些樣品PCR擴增未獲得相關(guān)目的片段，未獲得的序列在表4中用“/”標出。

對14個蚊蟲樣依據(jù)序列相似性和種類遺傳距離進行分子鑒定，共鑒定出6種蚊蟲，其中樣品1、2、3、4、11、12鑒定為兇小庫蚊，樣品5、7、8鑒定為尖音庫蚊(能力驗證樣品)，樣品6、10鑒定為里海伊蚊，樣品9鑒定為赫坎按蚊，樣品13鑒定為致倦庫蚊(喀什機場截獲)，樣品14 鑒定為白紋伊蚊。樣品鑒定結(jié)果、對應(yīng)樣品編號、所獲得的基因片段如表3所示。

2.2 ITS1、ITS2、Cytb、COI堿基含量統(tǒng)計

將所測序列進行拼接校對，在NCBI 網(wǎng)站上運行BLAST 程序可以確定測得序列為昆蟲的ITS1、ITS2、Cytb、COI基因序列。通過與 GenBank中的相關(guān)基因序列進行比較，結(jié)合 GenBank 中下載的與該ITS1、ITS2、Cytb、COI序列同源性較高的蚊類的序列(本文中所獲得的核酸序列均能反應(yīng)是蚊蟲中的相關(guān)基因的序列)，用 ClustalX1.83 軟件進行比對，將非保守區(qū)域去除，測序拼接后僅以表4中的序列長度進行分析。通過DNAman軟件分析本文所獲得的各個基因序列所有位點中AT堿基含量和GC堿基含量如表4所示。

表4 核苷酸使用頻率統(tǒng)計Tab.4 Statistics on nucleotides

2.3 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建結(jié)果

測序獲得的樣品COI、Cytb、ITS2序列，結(jié)合與GeneBank 中相似性性較高的蚊類的相關(guān)序列，基于 Kimura-2-Parameter模型，用鄰近法(NJ, Neighbour-Jioning)構(gòu)建了COI、Cytb、ITS2基因的分子系統(tǒng)樹，系統(tǒng)樹如圖1、2、3所示。結(jié)果表明數(shù)據(jù)庫中某特定蚊蟲所在科、屬的分子數(shù)據(jù)越豐富，構(gòu)建出來的系統(tǒng)進化樹越能

體現(xiàn)進化程度，本文中獲得的COI、Cytb序列相對較ITS2多，因此系統(tǒng)進化樹反應(yīng)出的進化關(guān)系較豐富；而ITS1數(shù)據(jù)較少系統(tǒng)進化樹構(gòu)建較為困難且不能反應(yīng)出的進化關(guān)系。COI、Cytb、ITS2相似性比對均有較高的相似性，如樣品多數(shù)COI基因序列與NCBI中相關(guān)序列覆蓋度較高且相似性高達99%，利用構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，也利于分子鑒定。

3 討論

3.1 分子鑒定結(jié)果分析

蚊類種類鑒定依據(jù)種內(nèi)遺傳距離序列相似性進行。拼接校對所測序列，在 NCBI 網(wǎng)站上運行BLAST程序，依據(jù)序列相似性進行鑒定；鑒定結(jié)果如表3所示，最高得分、覆蓋度、相似度、可能物種等都是鑒定的依據(jù)。對達到相似度標準的序列，可以鑒定到種；未到標準的為新序列。樣品多數(shù)COI基因序列與NCBI中相關(guān)序列相似性高達99%，大于或等于鑒定水平98%，因此可以鑒定為該種類昆蟲，即根據(jù)Hebert(2003a，b)中提出的具有足夠核酸信息的COI基因種內(nèi)遺傳距離小于等于0.02時，可將其鑒定為同一種類，在此NCBI數(shù)據(jù)中的最高得分、覆蓋度、相似度(遺傳距離的補數(shù))；例如，樣品14與NCBI中MF185679.1白紋伊蚊COI基因的相似度為100%，因此樣品14確定為白紋伊蚊；再如樣品5、8的ITS1序列與NCBI中的序列相似度高達98%，因此可以鑒定為兇小庫蚊。ITS1,ITS2相似度大于97%、Cytb,COI相似度大于98%視為相似度達到物種鑒定標準或水平，即能夠?qū)崿F(xiàn)準確鑒定。如樣品5、8的ITS1序列，如樣品2、8、9、13的ITS2序列，與NCBI中的序列相似度大于97%，鑒定為相似度最高的蚊類物種；如樣品2、3、4、6、7、8、10、11、12的Cytb序列，樣品1、2、3、4、6、7、9、11、12、13的COI序列，與NCBI中的序列相似度大于98%，鑒定為相似度最高的蚊類物種；且與圖1、2系統(tǒng)進化樹中的各自已知種類聚為一簇，能夠?qū)﹁b定結(jié)果進行較好的印證。單個序列或多個序列的鑒定結(jié)果是一致的，可以確定每個樣品都進行了準確鑒定，鑒定結(jié)果如表4所示。樣品13出現(xiàn)ITS1相似度為96%，ITS2相似度為97%，ITS1相似度未達到鑒定水平要求，不能作為準確鑒定的參考，在此選在ITS2作為鑒定參考，因此樣品13鑒定為致倦庫蚊；相似度較低時，需要在進行其他相關(guān)基因的擴增并獲得序列，以驗證結(jié)果的準確性，如樣品13需要進一步做COI或其他基因來驗證。ITS1、ITS2、Cytb序列相似度低于鑒定水平，說明數(shù)據(jù)庫中關(guān)于實驗樣品相關(guān)蚊類的ITS1、ITS2、Cytb序列還不夠豐富，本研究獲得的ITS1、ITS2、Cytb新序列較多，新的COI序列較少，在表3中標出，獲得的新的序列有助于后續(xù)利用ITS1、ITS2、Cytb序列進行快速鑒定。同時也說明蚊類COI序列研究的較多，該類蚊蟲的ITS1、ITS2、Cytb基因序列有待豐富。

3.2 ITS1、ITS2、Cytb、COI堿基含量分析

核酸使用率統(tǒng)計表明，Cytb、COI基因序列的AT含量明顯高于GC含量AT含量，表現(xiàn)明顯的A+T堿基偏嗜，且A與T含量相當，符合昆蟲線粒體基因堿基組成的基本特征。ITS1、ITS2、Cytb、COI基因均與NCBI數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)基因相對應(yīng)，因此分析表明這4類基因序列均能在分子水平上對蚊類進行檢測分析。

3.3 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建與分析

文中該類樣品的ITS1相似度較低，達到種內(nèi)遺傳距離鑒定標準的序列較少，說明文中該類樣品的ITS1數(shù)據(jù)較少，利用該序列進行快速鑒定有鑒定失敗的風險，說明文中該類樣品的該基因有待進一步豐富，本文沒有構(gòu)建文中該類樣品的ITS1基因的系統(tǒng)進化樹；相反文中該類樣品的COI基因達到種內(nèi)遺傳距離鑒定標準的序列較多，說明文中該類樣品的COI數(shù)據(jù)較多，利用該基因進行快速鑒定大都能夠?qū)崿F(xiàn)快速鑒定。文中該類樣品的ITS2、Cytb系統(tǒng)系統(tǒng)進化樹數(shù)據(jù)介于ITS1和COI之間，且覆蓋度較低，不利于建樹分析遺傳距離(如樣品2的Cytb基因覆蓋度低時表達出來的核酸信息不足，可能和其他種類通過少量信息耦合，建樹時不能準確的反映進遺傳距離)，說明有待補充和豐富，以便于以后在COI基因擴增測序不利時，利用ITS1、ITS2和Cytb基因?qū)υ擃悩悠愤M行快速鑒定。從COI、ITS2和Cytb各自基因NJ系統(tǒng)進化樹可以分析得知：鑒定的目標蚊種均能和NCBI數(shù)據(jù)中相應(yīng)蚊種COI、ITS2和Cytb基因聚成一簇，遺傳進化分支清晰明確。但是COI基因尖音庫蚊有兩個分支，且不能聚成一簇；兇小庫蚊和尖音庫蚊的其中一支遺傳距離較近，明顯聚成一簇；Cytb基因；尖音庫蚊和兇小庫蚊之間的關(guān)系與COI基因類似，其中樣品2COI(Culexmodestus)和Cytb(Culexinatomii(modestus))基因分別簇與不同的分支；而ITS2基因樣品2則與Culexmodestus聚為一簇；以上分歧說明樣品的分子鑒定有待進一步分析。

圖1 部分蚊種的COI基因 NJ 分子系統(tǒng)樹Fig.1 NJ phylogenetic tree of COI gene from partial mosquito species注：圖中數(shù)字表示置信度；我們的樣本COI用實心三角標出。 Note：Integer indicates bootstrap confidence values，and our samples are marked in solid triangles.

圖2 部分蚊蟲的CytB基因 NJ 分子系統(tǒng)樹Fig.2 NJ phylogenetic tree of CytB gene of partial mosquito species注：圖中數(shù)字表示置信度；我們的樣本用實心三角標出。 Note：Integer indicates bootstrap confidence values，and our samples are marked in solid triangles.

圖3 部分蟲類ITS2序列NJ分子系統(tǒng)樹Fig.3 NJ phylogenetic tree of ITS2 gene of partial mosquito species注：圖中數(shù)字表示置信度；我們的樣本ITS2用實心三角標出。 Note：Integer indicates bootstrap confidence values，and our samples are marked in solid triangles.

本研究利用DNA條形碼技術(shù)，結(jié)合形態(tài)學分類方法，通過提取蚊類DNA，檢索或設(shè)計適用于蚊類相關(guān)基因擴增的引物進行PCR擴增并測序，獲得了文中一些類蚊蟲樣本的ITS1、ITS2、Cytb、COI基因的序列，根據(jù)種內(nèi)遺傳距離和NJ樹分析表明這些基因序列都可作為特定蚊蟲DNA條形碼數(shù)據(jù)；各種類相關(guān)基因各自成簇，遺傳進化關(guān)系相對清晰；該研究獲得了幾種蚊蟲的DNA 分子特征,豐富了蚊蟲基因序列的數(shù)據(jù)庫，為快速鑒定提供多條新的參考序列。