杜 磊,李延暉,楊云霜,張 蓉△

1.北京市隆福醫(yī)院治未病科(北京 100010);2.火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心中醫(yī)科 (北京 100088)

隨著各行業(yè)領(lǐng)域?qū)四艿牟粩嚅_發(fā)利用，人們遭受核輻射的潛在風(fēng)險日益增加，免疫系統(tǒng)是對核輻射損傷最敏感的組織器官。IL-12、IFN-γ是細(xì)胞免疫過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，IFN-γ不僅具有相關(guān)免疫活性,而且可作用于多種參與更新和重建的細(xì)胞體系中，影響其分化和形成，二者共同誘導(dǎo)Th0向Th1分化，刺激免疫應(yīng)答。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，補腎解毒方能減輕輻射后小鼠脾、胸腺等免疫器官損傷[1-2],基于此，本實驗通過檢測IL-12、IFN-γ分泌水平的變化，探究此方對輻射后小鼠免疫系統(tǒng)的防護(hù)機制。

材料與方法

1 動 物 SPF級C57BL/10J小鼠，8周齡，體質(zhì)量(25±3) g，南京大學(xué)生物醫(yī)藥研究院提供，動物合格證號：[SCXK(蘇)2018-0008]。飼養(yǎng)于北京師范大學(xué)生命科學(xué)院實驗動物中心，自由攝食進(jìn)水。

2 試 藥 補腎解毒方顆粒組成：山萸肉12 g，熟地黃、山藥、牡丹皮、澤瀉、茯苓、白花蛇舌草各10 g,冬蟲夏草3 g。由康仁堂藥業(yè)有限公司制成中藥顆粒制劑。將上方顆粒與無菌水混合煎煮，過濾，濃縮濾液配置出濃度為1.38 g/ml藥液，分裝置4 ℃冰箱保存。IL-12 ELISA試劑盒(規(guī)格型號：96T，北京瑞格博科技發(fā)展有限公司)，IFN-γ ELISA試劑盒(規(guī)格型號：96T，北京瑞格博科技發(fā)展有限公司)。

3 儀 器60Coγ-輻射裝置(北京伽瑪高新有限公司生產(chǎn)，型號：GM-11-03-A),由北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院提供，高速臺式冷凍離心機(上海天美科學(xué)儀器有限公司,型號:CT15RT)。

4 分組、造模及給藥 90只C57BL/10J小鼠隨機分為五組：空白組、輻射組、氨磷汀組、補腎解毒方防治結(jié)合組和補腎解毒方預(yù)防組,每組18只。防治組與預(yù)防組小鼠每日予以補腎解毒方濾液灌胃(0.25 ml/只)，余三組予以等容積生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥10 d，第11天，除空白組外所有小鼠接受與照射源等距離的一次性4Gy60Co γ-射線全身照射，同時氨磷汀組小鼠在輻射前30 min內(nèi)按照200 mg/kg體重常規(guī)劑量注射氨磷汀。照射后，防治組繼續(xù)給予補腎解毒方濾液灌胃，余四組予以等容積生理鹽水灌胃,并于輻射后第1、7、14天取材，眼球取血，分離血清，采用ELISA法檢測血清中IL-12、IFN-γ水平。

5 血清IL-12、IFN-γ水平測定 血液在室溫下自然凝固20 min，放入離心機離心15 min(3000轉(zhuǎn)/ min)，收集上清，應(yīng)用ELISA法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計算出小鼠血清IL-12、IFN-γ水平。嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行。

結(jié) 果

1 補腎解毒方對輻射小鼠血清IL-12水平的影響 表1顯示，輻射后第1天，氨磷汀組IL-12水平高于輻射組(P<0.05)；輻射后第7天，防治組IL-12水平高于輻射組(P<0.05)；輻射后第14天，各組間無統(tǒng)計學(xué)差異。

2 補腎解毒方對輻射小鼠血清IFN-γ水平的影響 表2顯示，輻射后第1天、14天，各組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異；輻射后第7天，防治組IFN-γ水平高于輻射組與氨磷汀組(P<0.01，P<0.05)，同時預(yù)防組高于輻射組(P<0.05)，空白組高于輻射組和氨磷汀組(P<0.05)。

表1 補腎解毒方對輻射小鼠血清IL-12水平的影響(ng/L)

注：同時間點各組與輻射組比較，*P<0.05

表2 補腎解毒方對輻射小鼠血清IFN-γ水平的影響(ng/L)

注：同時間點與空白組比較，▲P<0.05；同時間點與輻射組比較，*P<0.05；同時間點與氨磷汀組比較，△P<0.05

討 論

免疫系統(tǒng)是對輻射高度敏感的靶器官，輻射產(chǎn)生過量自由基，通過能量的大量傳遞，導(dǎo)致DNA雙鏈結(jié)構(gòu)斷裂(Double-strandbreaks,DSBs)和生物大分子損傷,誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡，對免疫系統(tǒng)造成傷害[3-4]。

IL-12、IFN-γ是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的低分子量可溶性蛋白質(zhì)，二者共同促進(jìn)機體細(xì)胞功能彼此協(xié)調(diào)和發(fā)揮效應(yīng)，具有調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫的功能[5]。IL-12為由p35-p40亞單位組成的異質(zhì)二聚體，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)[6-8]，IL-12可調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，同時增加Th1型因子，如IFN-γ的分泌[9]，是免疫應(yīng)答過程中的重要調(diào)節(jié)因子。IFN-γ作為重要的宿主免疫防御環(huán)節(jié)，功能廣泛，Nakanishi等[10-11]發(fā)現(xiàn)，它可促進(jìn)MHC分子表達(dá)和抗原提呈，誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化，抑制Th2細(xì)胞分化。多項動物實驗證明[12]：IFN-γ基因敲除小鼠免疫能力弱于正常鼠。故二者在免疫過程中發(fā)揮著不可替代的作用。

實驗中觀察到小鼠受輻射后多有食欲減退、出血、皮膚毛發(fā)損害等癥狀，而臨床中的輻射病也多見惡心、嘔吐、出血、皮膚燒燙傷、毛發(fā)脫落等癥狀，因此由癥狀推求病因，可知輻射在中醫(yī)病因中歸類于火熱毒邪一類，其特性暴戾猛烈、耗氣傷精，易燔灼營血，致肝腎之精血枯竭，治當(dāng)滋陰填精，清熱解毒。補腎解毒方由滋補腎陰經(jīng)典方六味地黃丸化裁而來，六味地黃丸肝脾腎并補，尤善補腎之真陰，考慮到火熱毒邪最易耗傷腎陰根本，故補腎之真陰成為防治輻射后機體的免疫損傷的關(guān)鍵方面[13]。國內(nèi)外多項研究證明[14-15]，六味地黃丸有促進(jìn)新陳代謝、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等作用?？紤]到熟地滋膩礙胃的特性，在此基礎(chǔ)上，我們將熟地減量至10 g，以減輕輻射后胃腸道的負(fù)擔(dān)，并加入冬蟲夏草3 g，白花蛇舌草10 g；冬蟲夏草首載于《本草從新》，補腎益肺，專補命門，主要活性成分真菌多糖、蟲草酸可提高骨髓造血功能，抑制癌細(xì)胞分裂[16]，Hwang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，這些主要活性成分還具有抗氧化、提高免疫力的功能。白花蛇舌草具有清熱解毒、利濕通淋之效，參與內(nèi)皮細(xì)胞的增殖凋亡，內(nèi)含總黃酮成分能促進(jìn)IL-12、IFN-γ等細(xì)胞因子的增多[18]。諸藥合用，共奏扶正祛邪之功。

實驗結(jié)果顯示,輻射后第1d，氨磷汀組IL-12水平高于輻射組，各組間IFN-γ水平比較無統(tǒng)計學(xué)差異；表明補腎解毒方對輻射急性期IL-12、IFN-γ無明顯影響，氨磷汀上調(diào)了IL-12水平，表現(xiàn)出防護(hù)作用。輻射后第7天，防治組IL-12水平高于輻射組，IFN-γ水平防治組高于輻射組與氨磷汀組，同時預(yù)防組高于輻射組，空白組高于輻射組和氨磷汀組，防治組效果最優(yōu)，預(yù)防組次之。表明輻射中期，補腎解毒方能提高IL-12、IFN-γ水平，促進(jìn)輻射后機體損傷的修復(fù)，且輻射后繼續(xù)給藥能發(fā)揮最佳防護(hù)效果，氨磷汀作為目前最常用的輻射防護(hù)劑，目前在臨床上僅應(yīng)用于大量接觸射線之前的患者，輻射之后給藥則未顯現(xiàn)療效，而中藥在輻射前后均能發(fā)揮療效。輻射后第14天，各組IL-12、IFN-γ水平比較無統(tǒng)計學(xué)差異，表明了機體自身修復(fù)能力，中低劑量照射后，無論是否用藥，隨著自我修復(fù)的啟動，各項指標(biāo)逐漸趨于正常。

綜上，補腎解毒方顆粒能提高輻射后小鼠血清中IL-12、IFN-γ的分泌水平，增強機體免疫力，為我們未來進(jìn)一步發(fā)掘此方對輻射后的免疫防護(hù)機制奠定了堅實的基礎(chǔ)。