朱佩佩++李艷梅++侯泳志++楊英軍

摘要：從NCBI網(wǎng)站篩選到97條薔薇科植物PGIP基因序列，用鄰位相接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析他們之間的親緣關(guān)系。結(jié)果表明，薔薇科植物PGIP基因可聚為17個類群，這與傳統(tǒng)的分類結(jié)果基本一致，初步探討了吐根樹、耆葉梅、Cercocarpus ledifolius、Purshia tridentate、Horkelia cuueata和卡塔林硬木的親緣關(guān)系，對進(jìn)一步研究薔薇科植物之間進(jìn)化與親緣關(guān)系提供參考。

關(guān)鍵詞：薔薇科植物；PGIP基因；分子進(jìn)化樹；親緣關(guān)系

中圖分類號：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）21-5672-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.059

Construction and Analysis of Molecular Phylogenetic Tree of

Rosaceae plants Based on PGIP gene

ZHU Pei-pei， LI Yan-mei， HOU Yong-zhi， YANG Ying-jun

（College of Forestry， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， Henan，China）

Abstract： 133 PGIP genes of Rosaceae family from the NCBI web site were obtained， 97 complete available sequences were screened for using to analyse the evolutionary relationship. Molecular dendrograms were constructed by using MEGA6 methods. Phylogenetic tree analysis showed that PGIP genes can be mainly divided into 17 groups，and the classification results were the same as the based on traditional ways. The PGIP genes evolutionary relationship from Porteranthus trifoliatus，Chamaebatiaria millefolium，Cercocarpus ledifolius，Purshia tridentate、Horkelia cuueata and Lyonothamnus floribundus had the closest relationships. The study provided theoretical basis for the genetic evolution of Rosaceae plants.

Key words： Rosaceae；PGIP genes；molecular phylogenetic tree；genetic relationship

薔薇科（Rosaceae）是一類重要的植物種類，目前全世界約有124屬，3 300余種，主要分布于北半球溫帶地區(qū)。中國共有51屬，1 000余種。本科植物中大多數(shù)種類果實含豐富的維生素、糖和有機(jī)酸等，有許多是重要的水果和干果，也是一些重要的食品與醫(yī)藥的加工原料。

植物在自然界中受到各種病菌侵害的危險。病菌菌絲侵染植物細(xì)胞壁時，能分泌多種水解細(xì)胞壁的酶，如多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）、果膠甲基酯酶（Pectin methylesterase，PME）、果膠裂解酶（Pectate lyase）等[1]。其中多聚半乳糖醛酸酶可以降解植物細(xì)胞壁中的果膠、破壞細(xì)胞的完整性[2，3]。植物在抵御病原菌的進(jìn)化中，也步形成了一系列自衛(wèi)防御機(jī)制，如生成多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（Polyga-lacturonase inhibiting protein，PGIP）。PGIP是一種特異性結(jié)合和抑制真菌內(nèi)切PG活性的植物防御蛋白，能專一性、可逆地與真菌多聚半乳糖酶結(jié)合，競爭性抑制病原菌PG酶的活性，阻斷病原菌的侵染和抑制相應(yīng)病害的發(fā)生[1，4]。此外，PGIP在與PG的相互作用使植物細(xì)胞壁形成有生物活性的寡聚半乳糖醛酸（Oligogalacturonide，OG），能有效地激活植物體內(nèi)的防御系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)植物的抗病性響應(yīng)，植物獲得系統(tǒng)抗病性[5]。在植物免疫方面，PG-PGIP的互作方式已成為蛋白質(zhì)識別的模式系統(tǒng)[6]。另有報道， PGIP還與花器官發(fā)育[7，8]、種子萌發(fā)[9]、脅迫反應(yīng)、果實冷藏和果實的病蟲害響應(yīng)有關(guān)[10]。因而，PGIP的研究已成為抗病基因工程和果實耐貯藏基因工程研究的熱點。研究人員已經(jīng)克隆了多種植物PGIP基因[11-18]。

目前，世界主要的數(shù)據(jù)庫已經(jīng)收錄了多種植物 PGIP基因序列信息，本研究對薔薇科植物PGIP基因序列進(jìn)行篩選、整理，經(jīng)過比對、分析，探討薔薇科植物各屬各種之間的進(jìn)化與演化關(guān)系，為薔薇科植物分類、鑒定和新品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源與獲得

所有序列信息主要來自美國NCBI（The National Center for Biotechn-ology Information）網(wǎng)站，進(jìn)入NCBI主頁（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），選擇下載序列。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)甄別與篩選 打開下載的基因序列，查看序列信息，將非PGIP基因、長度極短序列全部排除，整理篩選序列，備用。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 運(yùn)用MEGA6軟件進(jìn)行多序列比對，并用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建N-J進(jìn)化樹，并采用Bootstrap 1 000檢驗分子系統(tǒng)樹各分支的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列搜索

至2014年5月30日，在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索可以得到薔薇科植物PGIP基因序列共計133條。經(jīng)過進(jìn)一步篩選，共得到97條準(zhǔn)確可用的基因序列（表1）。

2.2 聚類分析

2.2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析 對97條基因序列運(yùn)用MEGA6軟件進(jìn)行比對，并用鄰接法構(gòu)建分子進(jìn)化樹（圖1）。

通過對進(jìn)化樹的分析，可見薔薇科植物的97條PGIP基因序列大致可以分為十七個類群（表2），其中屬于蘋果亞科的植物23個，被分在3個群中，薔薇亞科的植物28個，分在4個群中，繡線菊亞科植物19個分在3個群中，李亞科植物6個分在2個群中，還有一個群中含有薔薇亞科、李亞科兩個亞科，有4個群的植物分類地位沒有確定。各群所含有的植物數(shù)量不同，但這些植物的PGIP基因序列在或遠(yuǎn)或近的距離內(nèi)先后聚類到一起，說明PGIP基因在這些植物的某方面存在類似的特征或特性。

3 小結(jié)與討論

植物病菌菌絲侵染植物時，會釋放出PG破壞植物的細(xì)胞壁。PGIP作為細(xì)胞壁結(jié)合的特異性蛋白質(zhì)能夠與病原菌PGs專一地、可逆地結(jié)合，形成一種高親和的復(fù)合物抑制endo-PG活性，激活包括PGIPs在內(nèi)的一系列防衛(wèi)相關(guān)基因，增強(qiáng)植物的抗病性以抵御病原真菌的侵入[4，5]。據(jù)初步統(tǒng)計，國內(nèi)外已先后從薔薇科的許多植物中克隆了PGIP基因，并對其基因序列和氨基酸序列、蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)和組織特異性表達(dá)、PGIP在植物抗病中的作用以及在抗病育種中的應(yīng)用進(jìn)行了深入研究[12，16]。

本研究在Genebak上搜索得到有關(guān)薔薇科植物PGIP基因序列共計133條，除去長度過長或過短的序列，以及非DNA序列，一共得到97個物種的97條可以使用的序列。通過MEGA軟件對PGIP基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，繪制同源進(jìn)化樹。

在PGIP基因序列聚類分析中，薔薇科的4個亞科植物按照PGIP基因序列相似性程度的高低，基本依照傳統(tǒng)的種屬親緣關(guān)系先后聚類在不同的群中，表明根據(jù)基因序列進(jìn)行物種的演化分析是可行的。PGIP基因序列的相似性越高，則越先聚在一起。其中也有一些屬于同一亞科的植物卻聚在不同的聚群中，這可能與序列所屬的物種的種屬親緣關(guān)系較遠(yuǎn)或者是PGIP的相似性差異較大。

吐根樹、耆葉梅（蕨葉屬的一種）、蕨葉屬、Cercocarpus ledifolius、Purshia tridentate、Horkelia cuueata和卡塔林硬木等都是原產(chǎn)于北美山區(qū)的灌叢、林地或森林野生植物，它們物種的分類地位不夠明確。本研究聚類結(jié)果表明，吐根樹、Cercocarpus ledifolius、耆葉梅、蕨葉屬和Purshia tridentate的PGIP基因序列在較近的距離內(nèi)相聚，可能表明其親緣關(guān)系可能較近，卡塔林硬木與繡線菊亞科和薔薇亞科植物并列，顯示了他們之間較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。Horkelia cuueata是原產(chǎn)于美洲的薔薇科植物，目前尚未確定其分類地位，聚類結(jié)果顯示，其PGIP基因序列與委陵菜屬植物和蛇莓屬植物在較近的距離內(nèi)相聚，表明他們之間的親緣關(guān)系可能較近。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究薔薇科各亞科植物的起源、演化與親緣關(guān)系了提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] JUGE N. Plant protein inhibitors of cell wall degrading enzymes[J].Trends Plant Sci，2006，11：359-367.

[2] HAMANN T.Plant cell wall integrity maintenance as an essential component of biotic stress response mechanisms[J].Front Plant Sci，2012，3：1-5.

[3] ESQUERRE-TUGAYE M T，BOUDARD G，DUMAS B.Cell wall degrading enzymes， inhibitory proteins， and oligosaccharides participate in the molecular dialogue between plants and pathogens[J].Plant Physiol Biochem，2000，38：157-163.

[4] DE LORENZO G，DOVIDIO R，CERVONE F.The role of polygalactu-ronase-inhibiting proteins（PGIPs） in defense against pathogenic fungi[J].Annu Rev Phytopathol，2001，39：313-335.

[5] DOVIDIO R，MATTEI B，ROBERTIA S，et al. Polygalactu-ronases，polygalacturonase-inhibiting proteins and pectic oligomers in plant-pathogen interactions[J].Biochim Biophys Acta，2004， 1696：237-244.

[6] MISAS-VILLAMIL J C，VAN DER HOORN R A.Enzyme-inhibitor inter-actions at the plant-pathogen interface[J].Curr Opin Plant Biol，2008，11：380-388.

[7] HUANG L，LIU Y，YU X L，et al.A polygalacturonase inhibitory protein gene（BcMF19） expressed during pollen development in Chinese cabbage-pak-choi[J].Mol Biol Rep，2011，38：545-552.

[8] Shi H Y，Zhu L，Zhou Y，et al.A cotton gene encoding a polygalacturonase inhibitor-like protein is specifically expressed in petals[J].Acta Biochim Biophys Sin，2009，41：316-324.

[9] KANAI M，NISHIMURA M，HAYASHI M. A peroxisomal ABC transporter promotes seed germination by inducing pectin degradation under the control of ABI5[J].Plant J，2010，62：936-947.

[10] YAO C，CONWAY W S，REN R，et al. Gene encoding polygalacturonase inhibitor in apple fruit is developmentally regulated and activated by wounding and fungal infection[J]. Plant Mol Biol，1999，39：1231-1241.

[11] DI C X，LI M，LONG F，et al. Molecular cloning，functional analysis and localization of a novel gene encoding polygalacturonase-inhibiting protein in Chorispora bungeana[J].Planta， 2009，231：169-178.

[12] YAO C L，CONWAY W S. Purification and characterization of a polygalacturonase-inhibiting protein from apple fruit[J]. Biochem Cell Biol，1995，85：1373-1377.

[13] DEO A，SHASTRI N V. Purification and characterization of polygalacturonase-inhibitory proteins from Psidium guajava Linn.（Guava） fruit[J].Plant Sci，2003，164：147-156.

[14] MACHINANDIARENA M F，OLIVIERI F P，DALEO G R. Isolation and characterization of a polygalacturonase-inhibiting protein from potato leaves. Accumulation in response to salicylic acid，wounding and infection[J].Plant Physiol Biochem， 2001，39：129-136.

[15] FISH W W，DAVIS A R. The purification， physical/chemical characterization，and cDNA sequence of cantaloupe fruit polygalacturonase-inhibiting protein[J].Phytopathology，2004，94：337-344.

[16] STOTZ H U，POWELL A L，DAMON S E，et al. Molecular characterization of a polygalacturonase inhibitor from Pyrus communis L. cv. Bartlett[J].Plant Physiol，1993，102：133-138.

[17] 武彥霞，田建保，曹秋芬，等.扁桃PGIP基因的克隆及其序列分析[J].果樹學(xué)報，2008（25）：54-59.

[18] 羅 婭，湯浩茹，張 勇，等.草莓多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因（PGIP）的克隆及組織特異性表達(dá)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2010，18（3）：424-430.