譚嘉琦，韓秀清，成思瓊，吳云鋒，郝興安

(1.西北農(nóng)林科技大學，陜西楊凌 712100；2.陜西新世界果業(yè)集團有限公司，陜西楊凌 712100)

蘋果莖溝病毒(Applestemgroovingvirus， ASGV)是一種寄主范圍廣泛的潛隱性病毒，一般不表現(xiàn)出明顯的外部癥狀，但影響嫁接親和性，造成果實產(chǎn)量和品質(zhì)下降[1]。ASGV寄主范圍廣泛，除了蘋果外，還侵染梨、柑橘、櫻桃、杏等果樹和百合等多種寄主[2-4]。ASGV在中國蘋果產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍，調(diào)查顯示國內(nèi)主要蘋果產(chǎn)區(qū)西北高原果區(qū)、渤海灣果區(qū)、黃河故道果區(qū)主栽蘋果品種普遍帶毒，帶毒株率為33.4%～100%[5]。

ASGV是發(fā)形病毒屬(Capillovirus)的代表種。ASGV粒子為彎曲線狀[6-7]，病毒基因組約6.5kb，正義單鏈RNA?；蚪MRNA 含有2個開放閱讀框(ORF),編碼甲基轉(zhuǎn)移酶(Mt)、外殼蛋白(Coat protein,CP)和運動蛋白(Movement protein,MP)等多個蛋白[8-10]。ASGV病毒MP基因與CP基因相對保守,且CP基因的保守性更強[11-13]。

ASGV在栽培品種上不引起明顯癥狀，這對田間病害的識別與診斷帶來困難[14-15]。實施苗木脫毒及無毒栽培，可有效控制病害發(fā)生蔓延。建立高效靈敏的檢測技術(shù)，成為解決種苗檢疫、抗病性早期鑒定等基本問題的前提，也是果樹無毒化栽培的基本保障[16]。因此，對田間樣品及脫毒苗木進行病毒檢測，是控制病害的重要環(huán)節(jié)[17-18]。不僅如此，基于血清學技術(shù)，對病毒蛋白進行表達分析是研究病毒與寄主互作的重要方法[19-20]。因此，針對ASGV建立血清學檢測技術(shù)，不僅可以對田間樣品和脫毒苗木進行病毒檢測，也可以分析病毒蛋白表達。本研究利用原核表達系統(tǒng)獲得ASGV的外殼蛋白，并制備多抗血清。利用該蛋白建立針對ASGV的Western blot和DAS-ELISA檢測技術(shù)。這為病毒的田間樣品及脫毒苗木檢測、以及病毒蛋白的功能研究提供了技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ASGV毒源采自陜西楊凌果園，莖尖培養(yǎng)結(jié)合熱處理獲得的脫毒組培苗由陜西果業(yè)集團提供。大腸桿菌DH5α、 BL21及表達載體pET-32a由西北農(nóng)林科技大學植物病毒學實驗室保存；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、pGEM-T Vector 購自Promega 公司；TaqDNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、氨芐青霉素、卡納霉素、 DNA marker、IPTG、X-gal、Trizol 等購自大連寶生物公司(TaKaRa)。其他化學試劑均為國產(chǎn)化學純。引物根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫已發(fā)表基因序列設(shè)計，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用于克隆ASGV CP基因的引物序列分別為ASGV-CP1：5′-ATGAGTTTGGAAGACGTGC-3′，ASGV-CP2：5′-CTAACCCTCCAGTTCCAGA-3′。重組表達載體引物為ASGV-CP3： 5′-CG- CGGATCCAGTTTGGAAGACGTGC-3′，ASG- VCP4：5′-CCGGAATTCCTAACCCTCCAGTT- CCA-3′，其中下劃線部分分別為EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點。

1.2 方 法

1.2.1 蘋果葉片總RNA提取 采集蘋果葉片，液氮研磨后采用Trizol試劑盒提取葉片總RNA，具體操作參照說明書。測定核酸OD260/OD280值、結(jié)合1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度及完整性。

1.2.2 ASGV cp基因克隆 以蘋果葉片總RNA為模板，參照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第1鏈。反轉(zhuǎn)錄引物為oligod(T)-18。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，分別進行PCR擴增。反應(yīng)條件為：94 ℃變性4 min，94 ℃ 45 s，45 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化后與pGEM-T Vector連接，熱激法轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌中，在LB/Amp/IPTG/X-gal 平板上篩選克隆，挑取陽性克隆送生工生物工程(北京)股份有限公司測序，測序結(jié)果采用BLASTn工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行在線比對，采用ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools?clustalw2/index.html)軟件進行序列分析。

1.2.3 原核表達載體構(gòu)建 以獲得的含有目標基因的質(zhì)粒為模板，PCR擴增添加酶切位點，擴增條件同上。PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T Vector上，選取測序驗證的陽性克隆，經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后，與同樣酶切處理的pET30a在16 ℃下連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，挑取克隆并提取質(zhì)粒酶切鑒定。

1.2.4 重組融合蛋白的誘導條件優(yōu)化 將酶切鑒定陽性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，鑒定的陽性單克隆37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜后，按1%接種量接種到新的LB液體培養(yǎng)基(含有100 mg·L-1Kanamycin)中，分別在28 ℃、32 ℃和37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6 ～ 0.8 時，添加終濃度為0.5 mmol·L-1的IPTG 誘導0 h、2 h、4 h和6 h，分別收集菌體。用適量的細胞裂解緩沖液懸浮菌體，經(jīng)超聲波破碎，12 000 r·min-1離心10 min，分離上清液與沉淀，懸浮沉淀后進行SDS-PAGE 分析。以未誘導培養(yǎng)物為陰性對照。

1.2.5 蛋白純化與抗體制備 在最適表達條件下誘導表達目的蛋白，收集菌體后經(jīng)超聲波破碎，離心收集的上清通過His-Tag層析柱進行層析純化，用平衡緩沖液漂洗去除雜蛋白后洗脫目的蛋白。純化后的目的蛋白委托武漢愛博泰克生物科技有限公司制備抗體。

1.2.6 蛋白免疫印跡分析 提取蘋果葉片總蛋白，SDS-PAGE電泳分離后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，封閉后加入適量稀釋的抗體，再加入二抗羊抗兔IgG-HRP，進行Western blot 分析。

1.2.7 DAS-ELISA檢測 包被緩沖液稀釋抗體后加入酶聯(lián)板，37 ℃孵育2 h。取病葉用PBS緩沖液( pH 6.5) 研磨，離心后取上清滴加至酶聯(lián)板，4 ℃孵育過夜。加入稀釋的酶標抗體37 ℃孵育2 h。加入底物后用酶標儀在405 nm處讀取OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 ASGV CP基因克隆及表達載體構(gòu)建

提取蘋果葉片總RNA后，采用引物ASGV- CP1/2擴增ASGV CP基因。擴增產(chǎn)物測序結(jié)果表明，目標片段為714 bp，預測編碼237個氨基酸。所擴增基因與GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中ASGV不同分離物的 CP基因核苷酸同源率為88.80%～91.90%。采用引物ASGV-CP3/4在目標基因兩端添加酶切位點EcoRⅠ和BamHⅠ，回收酶切產(chǎn)物并克隆至原核表達載體pET30a(+)。經(jīng)PCR和測序驗證，序列正確的載體命名為pE-ASGV-CP。融合表達的重組蛋白含有6×his標簽，用于蛋白 純化。

2.2 ASGV CP的誘導表達

將pECASGV-CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后誘導表達，SDS-PAGE 分析表明：與陰性對照比較，含有pE-ASGV-CP的BL21經(jīng)IPTG誘導，在35 ku處出現(xiàn)預期的特異性蛋白表達條帶。在37 ℃ 培養(yǎng)條件下，誘導后2 h即出現(xiàn)特異性條帶，誘導 4 h和6 h后該條帶表達量逐漸略有增加，但變化量不大。在28 ℃、32 ℃ 和37 ℃表達條件下誘導4 h后，各溫度條件下均獲得目標蛋白的特異性表達，表達量基本一致(圖1)。進一步經(jīng)超聲波破碎后分析發(fā)現(xiàn)，目標蛋白在各溫度條件下均出現(xiàn)在沉淀中，上清液中幾乎不可見目標蛋白的表達。表明目標蛋白是以包涵體的形式在細胞中獲得表達。洗脫后純化蛋白主要在目標蛋白洗脫液中，在雜蛋白洗脫液中幾乎不可見目標蛋白(圖2)。

M.預染蛋白Marker；1、3、5.pE-ASGV-CP分別在28 ℃、 32 ℃和37 ℃的非誘導表達；2、4、6.pE-ASGV-CP分別在28 ℃、32 ℃和37 ℃的IPTG誘導表達

M.Pre-stained protein ladder,1,3,5.BL21 control of pE-ASGV-CP inE.coilat 28 ℃,32 ℃ and 37 ℃; 2,4,6.Induced pE-ASGV-CP expression inE.coilwith IPTG at 28 ℃,32 ℃ and 37 ℃

圖1 ASGV CP原核表達分析
Fig.1 Protein expression of ASGV CP inE.coil

M.預染蛋白Marker；1.pE-ASGV-CP非誘導表達；2.pE-ASGV-CP的IPTG誘導表達；3.pE-ASGV-CP誘導表達經(jīng)超聲破碎后上清液；4、5.pE-ASGV-CP誘導表達經(jīng)超聲破碎后沉淀物；6、7、8.非目標蛋白純化；9.ASGV CP純化

M.Pre-stained protein ladder;1.BL21 control of pE-ASGV-CP inE.coil；2.IPTG induced pE-ASGV-CP expression inE.coil；3.Supernatant of pE-ASGV-CP protein expression broken by ultrasonic wave;4,5.Precipitation of pE-ASGV-CP protein expression broken by ultrasonic wave; 6,7,8.Elution of non-targeted protein; 9.Elution of ASGV CP

圖2 ASGV CP過柱純化
Fig.2 Protein purification of ASGV CP with column

2.3 抗體制備及檢測

純化的蛋白委托公司制備多克隆抗體。制備的抗體采用ID-ELISA測定效價。將誘導表達的ASGV CP蛋白(500 ng/mL)包被酶聯(lián)板，采用ELISA法測定抗體效價。當血清稀釋度達 12 800后，其P/N值(OD405抗血清/OD405陰性血清)仍大于2.0，這表明所制備的抗體效價達到 1/12 800以上。

以稀釋2 000 倍的抗血清作為二抗，提取蘋果葉片總蛋白后，采用Western blot進行蛋白雜交分析。結(jié)果顯示，在預期大小的位置處，所制備抗體能與植物總蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)?？贵w對目標蛋白結(jié)合的特異性較好，背景清晰，且與陰性對照沒有特異性反應(yīng)(圖3)。

M.預染蛋白Marker；1、3.ASGV感染蘋果樣品；2、4.健康蘋果樣品

M.Pre-stained protein ladder;1,3.Total protein of ASGV infected apple; 2,4.Negative control of healthy apple

圖3 ASGV CP抗體Western Blot 分析
Fig.3 Western Blot analysis of ASGV CP

特異性評價：以脫毒組培苗為健康對照，以分別感染ASGV、ASPV和ACLSV的蘋果組培苗為材料，研磨提取健康汁液和病汁液包被酶標板，采用DAS-ELISA法測定所制備抗體特異性。分析結(jié)果表明，該抗體僅與ASGV樣品發(fā)生反應(yīng)，與其他病毒樣品及健康對照均無血清學反應(yīng)。

2.4 蘋果樣品檢測及應(yīng)用

2.4.1 高通量檢測及與RT-PCR方法的比較 取23份經(jīng)RT-PCR檢測為陽性的田間蘋果樣品，采用制備的抗體通過DAS-ELISA法檢測ASGV。檢測結(jié)果表明其中21份為ASGV陽性。進一步分析2份陰性樣品發(fā)現(xiàn)，其RT-PCR檢測表現(xiàn)為弱陽性。對38份經(jīng)RT-PCR檢測為陽性的帶毒組培苗進行DAS-ELISA檢測，所有的樣品均可檢出ASGV。這表明本研究所制備的ASGV抗體可通過DAS-ELISA法用于ASGV的檢測，檢測結(jié)果與RT-PCR法基本一致。

2.4.2 陜西多地蘋果樣品檢測 采用DAS-ELISA法測定陜西主要蘋果產(chǎn)區(qū)ASGV發(fā)生情況。檢測結(jié)果表明，陜西各主要蘋果產(chǎn)區(qū)ASGV均普遍發(fā)生。其中富縣(71.3%)、洛川(75.3%)、宜君(78.9%)、白水(73.8%)、耀州(74.5%)等地的發(fā)生率均在70%以上；黃陵(66.7%)、彬州(64.4%)、隴縣(62.3%)、千陽(65.7%)、禮泉(63.8%)、扶風(67.5%)、歧山(63.6%)等地 ASGV發(fā)生率在60%～70%；低于60%的僅有乾縣(59.6%)和富平(58.7%)兩個產(chǎn)區(qū)。

采用DAS-ELISA法對蘋果脫毒苗進行檢測，ASGV的帶毒率為6.25%。其中，T337的 8株脫毒苗、玉華早富的8株脫毒苗、以及麗噶的8株脫毒面未檢出ASGV；富士冠軍的8株脫毒苗中，有2株為ASGV陽性。

表1 ID-ELISA測定CP抗血清效價Table 1 Titer determination of prepared antiserum against recombinant CP by ID-ELISA

注：P/N值為OD405(抗血清)/ OD405(陰性血清)。P/N值大于2.0為陽性結(jié)果。如果OD405(陰性血清)值小于0.05，則在P/N值計算中取0.05。

Note:P/N is OD405(antiserum)/ OD405( negative serum). The positive result means that P/N value is over 2.0. If the value of OD405( Negative serum) is less than 0.05,0.05 is taken for P/N value calculation.

表2 DAS-ELISA測定抗血清特異性Table 2 Specificity evaluation of prepared antiserum by DAS-ELISA

注：OD405為抗血清值，健康樣品的OD405陰性血清值為0.012。

Note:OD405is for antiserum,and OD405for negative control from healthy samples is 0.012.

3 討 論

基于血清學的病毒蛋白檢測是病毒研究的重要工具[21-22]。一方面，在病毒檢測中，采用DAS-ELISA等血清學技術(shù)可以實現(xiàn)病毒材料的高通量分析，適用于對田間樣品和脫毒材料的初篩檢測[23-24]；另一方面，病毒蛋白的表達在病毒與寄主互作過程中發(fā)揮重要作用，對寄主中病毒蛋白表達的檢測需要利用相應(yīng)抗體[19-20]。

本研究采用原核表達的方法制備ASGV CP蛋白，純化后制備蛋白抗體。經(jīng)DAS-ELISA和Western blot分析，所制備的抗體可用于這兩種檢測方法。在本研究中，采用DAS-ELISA法分別檢測陜西蘋果主要產(chǎn)區(qū)ASGV病毒的發(fā)生情況。檢測結(jié)果表明，ASGV在陜西蘋果主要產(chǎn)區(qū)嚴重發(fā)生，各產(chǎn)區(qū)ASGV發(fā)生率在60%以上。基于血清學的DAS-ELISA檢測方法具有檢測樣品制備簡單、儀器設(shè)備要求較低、低成本和高通量等優(yōu)勢，適合于進行田間樣品的大規(guī)模檢測。病毒脫除是控制蘋果病毒病的主要策略和措施[25]。在病毒脫除的各環(huán)節(jié)中，進行病毒檢測以剔除帶毒苗是獲取無毒苗木的重要內(nèi)容。本研究采用DAS-ELISA法測定脫毒組培苗的ASGV帶毒情況。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)脫毒苗帶毒率較低，且檢測結(jié)果與RT-PCR法一致。同時，本研究所制備的抗體僅與ASGV發(fā)生反應(yīng)，而與潛隱病毒ASPV和ACLSV不存在血清學反應(yīng)。在含有ASGV的混合感染樣品中，也可以檢測到ASGV。不含有ASGV的混合感染樣品，則表現(xiàn)為血清學陰性反應(yīng)。這表明本研究制備的抗體可用于脫毒苗的ASGV病毒檢測。

外殼蛋白被認為參與病毒的侵染過程[26-27],CP作為ASGV的結(jié)構(gòu)蛋白，其表達和分布與病毒的侵染與復制密切相關(guān)。但是，與 ASGV CP互作的寄主因子目前還不清楚。為此，需要檢測病毒侵染過程中CP的表達量變化，并分析其與潛在的寄主因子互作關(guān)系。本研究采用Western blot分析蘋果葉片中病毒蛋白表達。所制備的抗體與健康葉片總蛋白無血清學反應(yīng)，而與ASGV感染葉片的總蛋白有特異性條帶表現(xiàn)。這表明本研究做制備的抗體可用于檢測植物材料中的病毒蛋白表達。