王循剛，徐田偉，劉宏金，胡林勇，張曉玲，耿遠(yuǎn)月，趙 娜，徐世曉

(1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧 810001；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

反芻動(dòng)物的消化道尤其是瘤胃中棲息著豐富的微生物，包括纖維素降解菌、淀粉降解菌等細(xì)菌，產(chǎn)甲烷菌等古菌，以及大量的原蟲(chóng)和真菌等[1-3]。這些微生物通過(guò)相互作用，共同保持瘤胃內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，在宿主對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、能量代謝和生理健康等方面起重要作用[4-6]。作為反芻動(dòng)物消化道中重要的發(fā)酵器官，瘤胃在大量微生物的協(xié)同作用下，可以高效率地對(duì)宿主所攝入的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行降解，產(chǎn)生大量能源物質(zhì)對(duì)機(jī)體的生命活動(dòng)進(jìn)行供能[7-8]。研究報(bào)道，隨著宿主的種類(lèi)、年齡、飼糧組成、飼養(yǎng)方式等的改變，瘤胃中微生物的組成和豐度也會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化[9-12]。除了瘤胃，反芻動(dòng)物的腸道微生物群落同樣值得關(guān)注，尤其是糞便微生物，往往認(rèn)為與宿主的營(yíng)養(yǎng)和健康密切相關(guān)[13]。許強(qiáng)等[14]通過(guò)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(Restricted fragment length polymorphisms，RFLP)分別分析了腹瀉和健康狀態(tài)下荷斯坦?fàn)倥Ｖ蹦c糞便中的微生物群落，發(fā)現(xiàn)直腸形成了獨(dú)特且復(fù)雜多樣的微生物群落環(huán)境，且腹瀉時(shí)其中的腸球菌屬、乳桿菌屬等顯著增加。Li等[15]通過(guò)對(duì)不同程度腹瀉林麝的糞便微生物進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與健康狀態(tài)下的微生物區(qū)系存在顯著差異?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，對(duì)糞便樣品化學(xué)成分的測(cè)定，有助于了解宿主對(duì)所攝入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化情況[16-17]，而對(duì)其中微生物群落結(jié)構(gòu)的分析，則可以了解宿主的生理健康狀況。藏系綿羊(Ovisaries)作為青藏高原地區(qū)特有的綿羊品種，長(zhǎng)期生活在海拔3 000 m以上，對(duì)青藏高原嚴(yán)酷的高寒環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，是藏區(qū)牧民重要的生產(chǎn)和生活資料[18]。瘤胃和直腸糞便這兩大微生物區(qū)系特征以及兩者之間的群落結(jié)構(gòu)差異研究對(duì)于了解藏系綿羊獨(dú)特的高原適應(yīng)性具有重要意義。目前，關(guān)于藏系綿羊消化道微生物的研究?jī)H圍繞瘤胃開(kāi)展[19-20]，而對(duì)直腸糞便微生物的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究以16S rRNA基因的V3-V4高變區(qū)作為分子標(biāo)記，利用IlluminaHiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)分別對(duì)藏系綿羊瘤胃和直腸糞便的微生物群落進(jìn)行高通量測(cè)序，探究藏系綿羊瘤胃和直腸糞便微生物菌群的結(jié)構(gòu)和組成，并對(duì)兩者之間的群落結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行分析，旨在為藏系綿羊的健康養(yǎng)殖、疫病防疫及相關(guān)營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究提供一定的數(shù)據(jù)積累。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

2016年4月至7月在青海省海北高原現(xiàn)代生態(tài)畜牧業(yè)科技示范園放牧樣地對(duì)藏系綿羊進(jìn)行天然放牧，牧草中含粗蛋白質(zhì)11.45%、粗脂肪 1.53%、中性洗滌纖維50.43%、酸性洗滌纖維 31.57%，地上生物量為103.71 g/m2。于7月挑選5只平均月齡為6月齡，平均體質(zhì)量為 (21.50±0.59)kg的天然放牧藏系公綿羊進(jìn)行樣品 采集。

1.2 樣品的采集與處理

分別采集每只綿羊的瘤胃液和糞便樣品，每組樣品5個(gè)重復(fù)。采集瘤胃液時(shí)，打開(kāi)羊的口腔，使用瘤胃插管法將瘤胃管從羊口腔緩慢插入，抽取瘤胃內(nèi)容物約50 mL，然后用4層紗布過(guò)濾，收集濾液；糞便采集時(shí)，于直腸處采集新鮮糞便約 5 g，裝入凍存管，編號(hào)后立即投入液氮中保存。所有樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃保存，待測(cè)。

1.3 DNA提取及高通量測(cè)序

取200 mg瘤胃液或糞便樣品，使用TIANGEN DNA提取試劑盒提取樣品的總DNA，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以樣品提取的總DNA為模板對(duì)細(xì)菌16S rRNA的V3～V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為：338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[21]，反應(yīng)體系為25 μL：Q5 high-fidelity DNA polymerase 0.25 μL，5×Reaction Buffer 5 μL，5×High GC Buffer 5 μL，dNTP(1×104μmol/L)0.5 μL，模板DNA 1 μL，正向引物(10 μmol/L)1 μL，反向引物(10 μmol/L)1 μL，H2O 11.25 μL。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：98 ℃預(yù)變性2 min；循環(huán)30次(98 ℃30 s； 50 ℃ 30 s；72 ℃1 min)；72 ℃延伸5 min，4 ℃冷卻，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)合格后使用凝膠回收試劑盒回收目的片段。通過(guò)IlluminaHiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)對(duì)DNA片段進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得原始數(shù)據(jù)后再進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析。

1.4 微生物多樣性的生物信息學(xué)分析

使用FLASH[22]和QIIME[23]對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接過(guò)濾，得到優(yōu)化序列，根據(jù)相似度為97%的原則對(duì)序列進(jìn)行操作分類(lèi)單元(Operational taxonomic unit，OTU)聚類(lèi)，并挑選出相對(duì)豐度最高的序列作為每個(gè)OTU的代表性序列。利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/)對(duì)每條代表性序列進(jìn)行物種注釋并構(gòu)建OTU分類(lèi)信息表，繪制在門(mén)水平和屬水平上的物種分布柱狀圖。計(jì)算每個(gè)試驗(yàn)樣本的α多樣性和β多樣性。α多樣性由反映群落豐富度的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)及反映群落多樣性的Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)進(jìn)行評(píng)估。β多樣性選擇利用加權(quán)遺傳距離矩陣(Weighted uniFracdistance)計(jì)算，并進(jìn)行PCoA分析。使用PICRUSt[24]進(jìn)行KEGG微生物基因功能預(yù)測(cè)分析。數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，組間差異利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 各樣品測(cè)序結(jié)果

經(jīng)測(cè)序，藏系綿羊瘤胃液和糞便10個(gè)樣品共獲得729 326條原始序列(Raw tags)，原始序列經(jīng)過(guò)濾后獲得優(yōu)化序列(Clean tags)651 449條，平均每個(gè)樣品含有(65 145±320)條，每條序列平均長(zhǎng)度為(435.20±2.78)bp。樣品的稀釋曲線趨于平緩(圖1-A)，說(shuō)明本試驗(yàn)測(cè)序所得數(shù)據(jù)量已經(jīng)覆蓋樣本中的絕大多數(shù)物種?；谙嗨贫却笥?7%的原則，將測(cè)序所得有效序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)，共得到1 207個(gè)OTU(圖1-B)，其中瘤胃中獨(dú)有的有479個(gè)，糞便中獨(dú)有的有309個(gè)，兩組間共享的OTU有419個(gè)。

2.2 微生物群落多樣性分析

2.2.1 α多樣性分析 為了研究藏系綿羊瘤胃和糞便微生物群落的豐富度和多樣性，對(duì)兩組的α多樣性指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算和差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。瘤胃微生物的Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)顯著高于糞便微生物(P<0.05)；而Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)在兩組之間差異均不顯著(P>0.05)。

表1 瘤胃和糞便微生物群落α多樣性分析Table 1 α diversity analysis between rumen and feces

2.2.2 β多樣性分析 為了探究藏系綿羊瘤胃和糞便微生物群落組成的差異性，基于樣本的OTU信息，計(jì)算樣本之間的加權(quán)遺傳距離矩陣(Weighted uniFrac distance)，并進(jìn)行PCoA分析，結(jié)果如圖2所示。瘤胃微生物群落聚為一類(lèi)，糞便微生物群落聚為一類(lèi)，且兩組樣品在第一軸均明顯分開(kāi)，表明樣品組內(nèi)相似程度要高于組間，且糞便樣品組內(nèi)的相似程度要高于瘤胃樣品。

圖2 基于加權(quán)遺傳距離矩陣計(jì)算的PCoA分析Fig.2 PCoA analysis based on matrix calculation by weighted genetic distance

2.3 不同分類(lèi)水平微生物群落結(jié)構(gòu)差異分析

在不同分類(lèi)水平上對(duì)測(cè)序所得有效序列進(jìn)行物種注釋?zhuān)驳玫?4個(gè)門(mén)，21個(gè)綱，27個(gè)目，44個(gè)科，107個(gè)屬。根據(jù)物種注釋信息，分別選擇樣品微生物在門(mén)分類(lèi)水平和屬分類(lèi)水平上相對(duì)豐度排名前10位的物種進(jìn)行柱狀圖比較(圖3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藏系綿羊瘤胃和糞便微生物在門(mén)分類(lèi)水平上組成相似，其中擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)是優(yōu)勢(shì)菌門(mén)；在屬水平上，細(xì)菌、理研菌科_RC9_gut_group和瘤胃球菌科_ UCG_010等是優(yōu)勢(shì)菌屬。

2.3.1 門(mén)水平微生物群落結(jié)構(gòu)差異 在門(mén)分類(lèi)水平上對(duì)兩組微生物群落中相對(duì)豐度大于1%的物種進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表2)，其中瘤胃微生物群落中相對(duì)豐度大于1%的門(mén)有5個(gè)，分別為擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、互養(yǎng)菌門(mén)、變形菌門(mén)和軟壁菌門(mén)，占門(mén)水平總豐度的98.74%；糞便微生物群落中相對(duì)豐度大于1%的門(mén)有8個(gè)，分別為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、疣微菌門(mén)、黏膠球形菌門(mén)、螺旋體門(mén)、變形菌門(mén)、藍(lán)藻菌門(mén)和軟壁菌門(mén)，占門(mén)水平總豐度的 98.81%。其中，瘤胃中厚壁菌門(mén)、疣微菌門(mén)、黏膠球形菌門(mén)、螺旋體門(mén)和藍(lán)藻菌門(mén)5個(gè)門(mén)的相對(duì)豐度極顯著低于糞便(P<0.01)；而擬桿菌門(mén)和互養(yǎng)菌門(mén)顯著高于糞便(P<0.05)。

圖3 門(mén)水平(A)和屬水平(B)上菌群組成(相對(duì)豐度前10)Fig.3 Composition of microbial community at phylum(A)and genus level(B)(top 10 of relative abundances)

表2 微生物相對(duì)豐度在門(mén)分類(lèi)水平上>1%的物種Table 2 Relative abundance >1% of microbial species at phylum level

2.3.2 屬水平微生物群落結(jié)構(gòu)差異 在屬分類(lèi)水平上對(duì)兩組微生物群落中相對(duì)豐度大于2%的物種進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘤胃中相對(duì)豐度大于2%的屬有9個(gè)，相對(duì)豐度最高的為細(xì)菌，其次為普雷沃氏菌屬_1、瘤胃菌屬和理研菌科_RC9_gut_group；糞便中相對(duì)豐度大于2%的屬有12個(gè)，其中豐度最高的為瘤胃球菌科_UCG_010，其次為細(xì)菌、理研菌科_RC9_gut_group和瘤胃球菌科_UCG_005。其中，瘤胃中瘤胃球菌科_UCG_010、瘤胃球菌科_UCG_005和擬桿菌屬等9個(gè)屬的相對(duì)豐度極顯著低于糞便(P<0.01)；而理研菌科_RC9_gut_group、克里斯滕森菌科_R-7_group和普雷沃氏菌屬_1等6個(gè)屬顯著高于糞便(P<0.05)。

2.4 微生物基因功能預(yù)測(cè)分析

利用PICRUSt軟件對(duì)瘤胃和糞便微生物群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析。共匹配到43個(gè)KEGG二級(jí)代謝通路，其中有顯著性差異的代謝通路有34個(gè)(P<0.05)。選取相對(duì)豐度大于1%的代謝通路共18個(gè)進(jìn)行熱圖比較(圖4)，豐度總和分別占總豐度的94.15%和94.16%。代謝通路主要富集在代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理和細(xì)胞過(guò)程四大類(lèi)。對(duì)18個(gè)代謝通路的相對(duì)豐度進(jìn)行兩組間比較，發(fā)現(xiàn)僅碳水化合物代謝在兩組間差異不顯著(P>0.05)；全局和概述地圖、氨基酸代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、脂代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、折疊分揀和降解、萜類(lèi)化合物和多酮類(lèi)化合物的代謝和外源物質(zhì)的生物降解與代謝，這8個(gè)代謝通路在糞便微生物中豐度較高(P<0.05)；能量代謝、輔因子和維生素的代謝、核苷酸代謝、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制與修復(fù)、糖生物合成與代謝、其他氨基酸代謝及次生代謝產(chǎn)物的生物合成和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，這9個(gè)代謝通路在瘤胃微生物中豐度較高(P<0.05)。

表3 微生物相對(duì)豐度在屬分類(lèi)水平上>2%的物種Table 3 Relative abundance >2% of microbial species at genus level

橫坐標(biāo)為組名，縱坐標(biāo)為功能基因的相對(duì)豐度。越偏藍(lán)色表示相對(duì)豐度越高，越偏黃色表示相對(duì)豐度越低。ns表示相對(duì)豐度值在兩組之間差異不顯著(P>0.05)；*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)；***表示差異極顯著(P<0.001)

Abscissa is group name and ordinate is relative abundance of functional genes. The closer to blue the color is, the higher relative abundanceis , while the closer to yellow the color is,the lower relative abundance is.ns=No significant difference(P>0.05); * Significant difference(P<0.05); ** Significant difference(P<0.01); *** Significant difference(P<0.001)

圖4 功能基因預(yù)測(cè)熱圖
Fig.4 Heat map of predicted function of microbiota

3 討 論

3.1 瘤胃和糞便的微生物群落多樣性

微生物群落的多樣性往往由α多樣性和β多樣性進(jìn)行評(píng)估。α多樣性反映了樣品中物種的多樣性和豐富度，具體評(píng)價(jià)指標(biāo)包括Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù)等。其中Chao1和ACE指數(shù)用于衡量物種豐富度即物種數(shù)量的多少；Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性。Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說(shuō)明樣品的物種多樣性越高[25]。本研究為了解藏系綿羊瘤胃和糞便微生物的多樣性水平，對(duì)Chao 1、ACE、Simpson和Shannon指數(shù)進(jìn)行計(jì)算評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藏系綿羊瘤胃微生物的Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)顯著高于糞便微生物，說(shuō)明瘤胃中的微生物群落豐富度較高，高豐富度的微生物群落可以使宿主更高效地對(duì)所攝入食物進(jìn)行分解代謝；而Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)在兩組之間無(wú)顯著差異，說(shuō)明兩組間菌群多樣性水平相似。王繼文等[26]研究表明，波爾山羊糞便的微生物多樣性要略高于瘤胃，這與本研究結(jié)果相悖，分析產(chǎn)生差異的原因可能是家畜品種和飼養(yǎng)方式不同所造成的，有研究表明在不同精粗比或不同營(yíng)養(yǎng)水平日糧飼喂下，瘤胃微生物和糞便微生物多樣性水平都會(huì)發(fā)生顯著改變[27-28]。微生物群落的β多樣性主要是用以評(píng)估樣品間物種多樣性差異，本研究中利用加權(quán)遺傳距離矩陣進(jìn)行PCoA分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藏系綿羊瘤胃微生物菌群能夠很清晰地和糞便菌群區(qū)分開(kāi)，說(shuō)明這兩者的菌群分別具有較高的穩(wěn)定性且在微生物結(jié)構(gòu)上具有較大差異。

3.2 瘤胃和糞便微生物在不同分類(lèi)水平上的群落結(jié)構(gòu)差異

Liu等[13]和張雪嬌等[29]研究均表明反芻動(dòng)物瘤胃微生物中相對(duì)豐度較高的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)依次為擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，這與本研究結(jié)果相同，即瘤胃中擬桿菌門(mén)豐度(54.40%±0.80%)顯著高于厚壁菌門(mén)(39.40%±0.90%)，但在糞便中卻呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，豐度最高的為厚壁菌門(mén)(50.30%±0.80%)，其次才為擬桿菌門(mén)(36.00%±1.10%)，這也與以往的研究結(jié)果相一致[30]。這種相似性的出現(xiàn)顯示反芻動(dòng)物胃腸道微生物菌群的共性特征。進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，在屬分類(lèi)水平上藏系綿羊瘤胃液中豐度較高的菌群為細(xì)菌(18.20%± 1.51%)、普雷沃氏菌屬1(12.10%±1.43%)和瘤胃菌屬(12.00%±1.10%)。其中普雷沃氏菌屬1在分類(lèi)學(xué)上隸屬于擬桿菌門(mén)，在瘤胃內(nèi)可以降解淀粉、蛋白質(zhì)、木聚糖等多類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用以能量供給和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等[31]，多項(xiàng)研究均證明普雷沃氏菌屬為反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群[32-33]。而在糞便中瘤胃球菌科UCG_010 (17.10%± 1.65%)、細(xì)菌(16.30%±0.52%)和理研菌科RC9_gut_group(8.63%±0.54%)豐度排名位于前三位。瘤胃球菌屬在分類(lèi)學(xué)上隸屬于厚壁菌門(mén)，Wang等[34]對(duì)小尾寒羊胃腸道不同區(qū)段微生物的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大腸中瘤胃球菌屬的相對(duì)豐度要顯著高于其他胃腸道部位。這與反芻動(dòng)物后腸所行使的生理功能相關(guān)，后腸中的瘤胃球菌屬能夠產(chǎn)生淀粉酶和纖維素酶等碳水化合物降解酶，用以破壞植物細(xì)胞壁，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)碳水化合物的分解發(fā)酵[35]。但從本研究結(jié)果來(lái)看，在屬水平仍存在許多未成功注釋到的基因序列，以及相對(duì)應(yīng)的基因功能，這就對(duì)總體結(jié)果的分析產(chǎn)生了一定影響，后續(xù)可以加入宏轉(zhuǎn)錄組等新興微生物學(xué)分析技術(shù)[36]，以實(shí)現(xiàn)對(duì)反芻動(dòng)物胃腸道微生態(tài)環(huán)境的更準(zhǔn)確認(rèn)知。

3.3 瘤胃和糞便微生物功能預(yù)測(cè)

使用PICRUSt軟件對(duì)藏系綿羊瘤胃和糞便微生物群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)基因功能主要富集在代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理和細(xì)胞過(guò)程四大功能類(lèi)群上。其中碳水化合物代謝在兩組中均富集程度最高且差異不顯著；瘤胃微生物在能量代謝、核苷酸代謝、糖代謝和其他氨基酸代謝等機(jī)體代謝功能上顯著富集；糞便微生物在氨基酸代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、脂代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能上顯著富集，這與已報(bào)道的奶牛胃腸道微生物功能研究結(jié)果相類(lèi)似[37]，說(shuō)明瘤胃微生物和后腸中的微生物均參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化代謝。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，藏系綿羊瘤胃中微生物的多樣性高于糞便中，瘤胃微生物和糞便微生物在結(jié)構(gòu)組成上相對(duì)穩(wěn)定且存在差異。