呂建華 李宏 曲文浩 賈周英 薛智權(quán)

摘? ? 要：本文旨在檢測不同濃度氯化鈉脅迫對高效降酚菌熱帶假絲酵母菌株GY8降解苯酚性能的影響。通過在含有0.1，10，25，50，100 g·L-1氯化鈉的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)GY8菌，檢測不同氯化鈉濃度脅迫對菌OD600值、降解苯酚速率，降酚關(guān)鍵酶的活性的影響。結(jié)果表明，GY8菌在含0～100 g·L-1鹽濃度培養(yǎng)基中均可生長，且都有降酚活性。但隨著鹽濃度增加，GY8菌OD600值和降酚速率及鄰苯二酚1， 2-雙加氧酶酶比活力均呈現(xiàn)抑制趨勢，苯酚羥化酶的活性先增強(qiáng)后抑制。當(dāng)氯化鈉濃度超過25 g·L-1時(shí)，抑制作用明顯增強(qiáng)。通過本研究可以得出GY8菌可耐受0～100 g·L-1氯化鈉，且氯化鈉對GY8降酚活性具有梯度抑制作用。

關(guān)鍵詞：降酚性能;熱帶假絲酵母菌;氯化鈉;苯酚羥化酶;鄰苯二酚雙加氧酶

中圖分類號：Q93? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.03.003

Effect of Salt Stress on the Phenol Degradation of Candida tropicalis GY8

LYU Jianhua， LI Hong， QU Wenhao， JIA Zhouying， XUE Zhiquan

（College of Life Science，Shanxi Agricultural University，Taigu， Shanxi? 030801，China）

Abstract：The aim of this study was to investigate the influence of different concentration of sodium chloride stress on phenol-degrading activity of Candida tropicalis GY8. GY8 strain were cultured in the inorganic salt medium containing 0.1， 10， 25， 50 and 100 g·L-1 sodium chloride. The effects of different concentrations of sodium chloride on the OD600 value， the phenol-degrading rate， and the key enzyme activities for phenol degradation were detected. The results showed that GY8 strain could grow in the culture medium containing 0～100 g·L-1 salt concentration， and all of them had the activity of phenol degradation. However， with the increase of salt concentration， the OD600 value， the phenol-degrading rate and the specific activity catechol 1， 2-dioxygenase of GY8 strain showed inhibitory trend. The activity of phenol hydroxylase increased first and then inhibited. When the concentration of sodium chloride was more than 25 g·L-1， the inhibition was obviously enhanced. This study concluded that GY8 strain can tolerate 0～100 g·L-1 salt concentration， and NaCl has a gradient inhibitory effect on the phenol-degrading activity of GY8.

Key words： phenol degradation; Candida tropicalis; sodium chloride; phenol hydroxylase; catechol 1， 2-dioxygenase

苯酚及其衍生物作為重要的有機(jī)化工原料，主要用于生產(chǎn)酚醛樹脂、烷基酚以及水楊酸等，被廣泛應(yīng)用于石油化工、醫(yī)藥、印染、造紙等行業(yè)[1-2]。在苯酚的制備和使用過程中都會使大量苯酚隨著工業(yè)廢水被排放，從而對環(huán)境造成影響。因此，含酚廢水在排放時(shí)要進(jìn)行預(yù)處理。

對于廢水中苯酚的處理可利用物理、化學(xué)和生物處理方法，但由于生物處理具有高效、經(jīng)濟(jì)和環(huán)保效果而備受關(guān)注。近20年來，許多學(xué)者已經(jīng)對生物降解苯酚進(jìn)行了嘗試。研究表明，許多微生物能夠耐受低濃度的苯酚，并且將酚類化合物分解代謝成無害的最終產(chǎn)物，因此，利用微生物處理含酚廢水是非常有效的方法[3-4]。

采用微生物降解工業(yè)廢水中的苯酚時(shí)，其降解效果會受到許多因素的影響。目前，國內(nèi)外在制備苯酚時(shí)，為了提高產(chǎn)量，常常加入大量含鈣、鎂、氯化鈉等無機(jī)鹽催化劑，從而使后期廢水中常同時(shí)含有苯酚以及高濃度的鹽分[5]。已有研究表明在采用活性污泥法處理廢水時(shí)，鹽度可以調(diào)控污泥的脫水性能，因此，常在活性污泥中加入一定的氯化鈉來提高污泥的固含量[6]。但氯化鈉的濃度太高會對微生物的生長產(chǎn)生抑制作用[7-9]。因此，為了使微生物能夠更好地生長繁殖，探究不同濃度鹽脅迫對菌株降解苯酚性能有何影響就變得尤為重要。

熱帶假絲酵母菌是一種高效降解苯酚的真菌，但鹽脅迫對菌株降解苯酚性能的影響還未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)組從污水處理廠的活性污泥中分離得到了一株具有較高降酚活性的熱帶假絲酵母GY8，并對其基本性質(zhì)進(jìn)行了研究[10]。本試驗(yàn)擬采用不同濃度的氯化鈉對熱帶假絲酵母GY8菌株進(jìn)行鹽脅迫，觀察高鹽對其生長特性、降酚特性及降酚關(guān)鍵酶活性的影響，為將熱帶假絲酵母GY8菌株應(yīng)用于高鹽含酚廢水的處理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源 本研究所用降解苯酚菌株熱帶假絲酵母 GY8篩選自山西省晉中市太谷縣圣源污水處理廠曝氣池中的活性污泥，并由本實(shí)驗(yàn)組保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基和PDB培養(yǎng)基：參照本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法配制[10]。

無機(jī)鹽篩選培養(yǎng)基（g·L-1）：參照本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法配制[11]，加入終濃度為0.1，10，25，50和100 g·L-1的氯化鈉，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行組。

1.1.3 試劑 本試驗(yàn)中所用化學(xué)試劑均為分析純，PDA培養(yǎng)基和PDB培養(yǎng)基購自北京澳博星科技公司，酵母提取物購自O(shè)XOID公司，NADPH購自上海羅氏制藥有限公司。其余為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 熱帶假絲酵母 GY8菌株活化 將保存菌株熱帶假絲酵母 GY8在PDA固體培養(yǎng)基上劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d。從PDA培養(yǎng)板挑取活化的單克隆菌，接種到滅菌的含PDB培養(yǎng)基的試管中，28 ℃，180 rpm，培養(yǎng)2 d后作為后續(xù)試驗(yàn)使用菌株。

1.2.2 鹽脅迫對熱帶假絲酵母GY8菌株生長影響 將1.2.1中培養(yǎng)的菌株接種到以苯酚為唯一碳源，氯化鈉濃度為0.1，10，25，50和100 g·L-1的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃恒溫震蕩器中，180 rpm，培養(yǎng)2 d，在培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液搖勻，從每個(gè)培養(yǎng)瓶中取150 μL菌液于酶標(biāo)板中，以蒸餾水為空白對照，測600 nm波長下菌液的OD值。

1.2.3 苯酚含量的測定 本文采用4-氨基安替比林法[12]來測定苯酚的含量，略有改進(jìn)。將培養(yǎng)液于5 000 r·min-1離心5 min后，取上清按照本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法測定苯酚含量[11]。

1.2.4 鹽脅迫對苯酚降解酶活性的影響 （1）粗酶液的提取。將1.2.2中離心后的菌體沉淀用pH=7.6磷酸緩沖液清洗兩次，然后用磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，加入終濃度為1 mg·mL-1的蛋白酶K，放入Scientz-65OE超聲波細(xì)胞破碎儀中，設(shè)定超聲工作時(shí)長5 s，間隙時(shí)長8 s，功率250 W，總工作時(shí)長為35 min，超聲破碎后，于4 ℃，12 000 r·min-1，離心20 min，收集上清液即為粗酶液[13]。

（2）酶活的測定。苯酚羥化酶活力測定參照文獻(xiàn)[14]，苯酚羥化酶反應(yīng)體系總體積為150 μL。每個(gè)樣品依次加入水，12 μL苯酚（終濃度20 μmol·L-1），6 μL Tris-H2SO4（100 μmol·L-1，pH值7.6），粗酶液和6 μL NADPH（100 μmol·L-1），混勻后取150 μL加入酶標(biāo)板，以126 μL水，12 μL苯酚，6 μL Tris-H2SO4，6 μL NADPH作為空白對照，用Muitiskan GOI酶標(biāo)儀檢測在340 nm處反應(yīng)6 min內(nèi)OD值的變化。其中1個(gè)單位（U）的苯酚羥化酶活性被定義為每毫克蛋白每分鐘氧化1 μmol NADPH所需酶量。鄰苯二酚-1， 2-雙加氧酶（C12O）活性測定參照文獻(xiàn)[11]，以單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物（粘糠酸）在260 nm處吸光度變化表示。鄰苯二酚1， 2-雙加氧酶反應(yīng)體系總體積為3 mL。每個(gè)樣品中依次加入水，2 mL Tris-HCL（50 mmol·L-1，pH值8.0），1 μL β-巰基乙醇（3.3 mmol·L-1），粗酶液，15 μL鄰苯二酚（100 μmol·L-1）。以984 μL水，2 mL Tris-HCL（50 mmol·L-1，pH值8.0），1 μL β-巰基乙醇（3.3 mmol·L-1），15 μL鄰苯二酚作為空白對照，用石英比色皿測在260 nm處OD值的變化?？偟鞍缀坑肂radford 法測定。酶的比活力以每毫克的蛋白質(zhì)中所含酶的活力單位數(shù)計(jì)算，計(jì)算公式如下：

酶的比活力=（（ΔAs-ΔAb）·V）/（ [ε·d·ΔT·mg （protein）]）

式中，ΔAs-樣品吸光度的變化值;ΔAb-空白對照吸光度的變化值;V-反應(yīng)體系總體積;ε-摩爾吸光系數(shù);ΔT-反應(yīng)時(shí)間。ε340 = 6 220 L·mol-1·cm-1，ε260=16 800 L·mol-1·cm-1，ε375 = 44 700 L·mol-1·cm-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對熱帶假絲酵母GY8菌株生長的影響

隨著培養(yǎng)基中氯化鈉濃度的逐漸升高，熱帶假絲酵母GY8菌液OD600值逐漸降低，表明菌液濃度越來越低，說明熱帶假絲酵母GY8菌株的生長隨著氯化鈉濃度的升高逐漸被抑制。其中在10 g·L-1氯化鈉脅迫下較0.1 g·L-1脅迫時(shí)下降了20.7%，而25 g·L-1氯化鈉脅迫下生長明顯受到抑制，較0.1 g·L-1脅迫時(shí)下降了49.3%（圖1）。

2.2 鹽脅迫對熱帶假絲酵母GY8菌株苯酚降解率的影響

隨著培養(yǎng)基中氯化鈉濃度的逐漸升高，氯化鈉脅迫下熱帶假絲酵母GY8菌株對苯酚的降解率與菌株的生長都呈現(xiàn)一致的下降趨勢，說明隨著氯化鈉濃度的升高，由于菌株生長受到抑制，從而導(dǎo)致菌株對苯酚的降解也逐漸被抑制。其中10 g·L-1氯化鈉脅迫下苯酚降解較0.1 g·L-1時(shí)下降了0.18個(gè)百分點(diǎn)，而在25 g·L-1氯化鈉脅迫下苯酚降解明顯受到抑制，較0.1 g·L-1時(shí)下降了0.58個(gè)百分點(diǎn)，較生長受抑制更加明顯（圖2）。

2.3 鹽脅迫對熱帶假絲酵母GY8菌株苯酚羥化酶活性的影響

當(dāng)熱帶假絲酵母GY8菌在含有氯化鈉的培養(yǎng)基中生長時(shí)，苯酚羥化酶的酶比活力呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。苯酚羥化酶在受到10 g·L-1氯化鈉脅迫時(shí)活性呈現(xiàn)上升趨勢，較0.1 g·L-1時(shí)酶活性提高了15.2%，從而在菌生長受到抑制時(shí)苯酚降解抑制程度減緩。當(dāng)菌株在超過25 g·L-1氯化鈉脅迫下苯酚羥化酶活性明顯受到抑制，較10 g·L-1時(shí)下降21.3%（圖3）。

2.4 鹽脅迫對熱帶假絲酵母GY8菌株鄰苯二酚1，2-雙加氧酶活性的影響

當(dāng)熱帶假絲酵母GY8菌生長的環(huán)境中氯化鈉濃度逐漸升高時(shí)，鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的酶活力呈現(xiàn)明顯下降趨勢，且在10 g·L-1氯化鈉脅迫時(shí)活性呈現(xiàn)明顯抑制作用，較0.1 g·L-1時(shí)酶活性降低了72.8%，表明鄰苯二酚1，2雙加氧酶的表達(dá)受到氯化鈉的明顯抑制（圖4）。

3 結(jié)論與討論

近年來，從含酚類污染物的環(huán)境中分離出各種能夠降解苯酚的微生物菌株。研究者還詳細(xì)地研究了這些菌株代謝苯酚的途徑及其基因調(diào)控機(jī)制[15]。目前，大量的研究工作結(jié)果表明，微生物對酚類污染物的降解存在著有效的作用和可觀的未來，降酚菌依靠苯酚羥化酶和鄰苯二酚1， 2-雙加氧酶來降解苯酚[16]。然而，我國的工業(yè)特別是化學(xué)工業(yè)排放的含酚廢水中往往含有很高濃度的鹽[4]，不利于微生物降解苯酚，因此，用微生物法處理鹽濃度高的含酚廢水變得非常困難。研究表明，菌株在10～100 g·L-1 的NaCl溶液條件下均能夠進(jìn)行生長，并對苯酚有降解能力，且菌株生長量和苯酚的降解率隨著鹽度的增加而降低，其羥化酶比活力隨之降低[17]。過高鹽度會抑制鄰苯二酚1，2-雙加氧酶基因的表達(dá)，其表達(dá)水平隨鹽度升高呈下降趨勢[18]。本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)濃度低于10 g·L-1的鹽環(huán)境有利于提高苯酚羥化酶活性，而隨著鹽濃度逐漸升高，苯酚羥化酶和鄰苯二酚1，2-雙加氧酶活性菌受到明顯抑制作用，因此，高濃度鹽的生長環(huán)境不利于熱帶假絲酵母GY8菌對苯酚的轉(zhuǎn)化降解，增大了苯酚降解的難度。通過本實(shí)驗(yàn)研究可以通過調(diào)整廢水中鹽度于酶活性范圍內(nèi)，從而為該菌株在鹽度較高的含酚廢水的處理應(yīng)用中提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]NAWI M A ， NAWAWI I . Preparation and characterization of TiO2 coated with a thin carbon layer for enhanced photocatalytic activity under fluorescent lamp and solar light irradiations[J]. Applied catalysis a： general， 2013， 453（Complete）：80-91.

[2]楊建設(shè)， 張冬梅， 陳茂壕， 等. 不同苯酚濃度下耐酚優(yōu)勢菌的活力比較[J]. 茂名學(xué)院學(xué)報(bào)， 2002， 12（4）： 13-17.

[3]NAIR C I， JAYACHANDRAN K， SHASHIDHAR S. Biodegradation of phenol[J]. African journal of biotechnology， 2008，7（25）：4951-4958.

[4]KATAYAMA-HIRAYAMA K， TOBITA S， HIRAYAMA K. Biodegradation of phenol and monochlorophenols by yeast Rhodotorula glutinis[J]. Water science & technology， 1994， 30（9）：59-66.

[5]張海濤， 劉文斌， 楊海君，等. 一株耐鹽高效苯酚降解菌的篩選、鑒定、響應(yīng)面法優(yōu)化與降酚動(dòng)力學(xué)研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 36（9）： 3200-3207.

[6]胡夢竹， 張海豐， 梁毅， 等. NaCl對污泥脫水性能及胞外聚合物分層結(jié)構(gòu)的影響[J]. 工業(yè)水處理， 2018， 38（12）：64-68.

[7]JUANG Ruey-Shin， HUANG Wen-Ching， HSU Ya-Han. Treatment of phenol in synthetic saline wastewater by solvent extraction and two-phase membrane biodegradation[J]. Journal of hazardous materials， 2009， 164（1）：46-52.

[8]LIVINGSTON A G， SANTOS L M F D， PAVASANT P， et al. Detoxification of industrial wastewaters in an extractive membrane bioreactor[J]. Water? science &technology， 1996， 33（3）：1-8.

[9]王祖佑， 馬慶霞， 陳怡，等. 優(yōu)勢降酚菌的篩選及其生長條件優(yōu)化研究[J]. 化學(xué)與生物工程， 2010， 27（4）： 61-62.

[10]呂建華， 李宏， 薛智權(quán). 高效降酚菌株GY8培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016， 22（9）：40-44.

[11]任瑞凡， 劉永陽， 曲文浩， 等. 一株苯酚降解菌株的篩選鑒定及特性研究[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2018， 24（11）：11-16， 50.

[12]國家環(huán)保局《水和廢水監(jiān)測分析方法》編委會. 水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）[M] . 北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社， 2002： 294-295.

[13]DONG X J， HONG Q， HE L J， et al. Characterization of phenol-degrading bacterial strains isolated from natural soil[J]. International biodeterioration & biodegradation， 2008， 62（3）：257-262.

[14]NEUJAHR H Y， GAAL A. Phenol hydroxylase from yeast. Purification and properties of the enzyme from Trichosporon cutaneum[J]. European journal of biochemistry， 1973， 35：386-400.

[15]馬放， 任南琪， 楊基先. 污染控制微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)出版社， 2002.

[16]PESSIONE E， DIVARI S， GRIVA E， et al. Phenol hydroxylase from Acinetobacter radioresistens is a multicomponent enzyme[J]. Febs journal， 1999， 265（2）：549-555.

[17]譚東徽， 曲媛媛， 馬放. Arthrobacter sp.W1苯酚降解特性及其羥化酶基因獲取[J]. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2010， 42（12）： 1977-1980.

[18]胡日查， 孫立波. 低溫1， 2， 4-TCB降解菌的選育、降解特性及鄰苯二酚 1， 2-雙加氧酶基因表達(dá)水平[J]. 環(huán)境工程學(xué)報(bào)， 2013， 7（2）： 777-782.