李 鵬，董嫁詩，劉鼎鑫

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319

北方寒區(qū)多年來飼養(yǎng)的地方良種鵝－籽鵝，產(chǎn)于黑龍江綏化和松花江地區(qū)，是世界上產(chǎn)蛋量最多的鵝種之一，一般年產(chǎn)蛋可達14～20 kg[1]。然而，隨著鵝產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，鵝的需求量逐年增加，但由于鵝繁殖性能較低，限制了鵝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。據(jù)專家預(yù)測，目前全國養(yǎng)鵝約6億多只，鵝肉產(chǎn)量70萬噸，約為牛羊肉產(chǎn)量的40%；市場缺口在3億只左右。利用分子生物學(xué)技術(shù)提高禽類繁殖性能的研究發(fā)展很快，在雞的研究方面尤為突出，國內(nèi)外均取得了較多的科研成果[3]。本研究針對影響籽鵝產(chǎn)蛋性能的主要基因即促卵泡素（FSH）、催乳素（PRL）、抑制素（INH）開展研究，以提高籽鵝的繁殖性能，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

選擇本地健康成年雌性籽鵝2只，取籽鵝卵泡及腦垂體。

1.1.2 所需試劑

pMD18T載體（購自寶生物工程（大連）有限公司）；pcDNA3.0、pET-32a載體（由本實驗室保存）；RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（購自天根生化科技（北京）有限公司）；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ（購自寶生物工程（大連）有限公司）；T4DNA 連接酶（購自北京鼎國生物科技有限公司）；其余試劑均為分析純試劑。

1.1.3 主要儀器

Pico-21型臺式離心機（美國Thermo Fisher生產(chǎn)）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠生產(chǎn)）；凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP生產(chǎn)）；T100TM型PCR儀（美國BIO-RAD生產(chǎn)）；LDZX-50KBS型高壓滅菌器（艾科儀器生產(chǎn)）；DRP-9272型培養(yǎng)箱（上海培因試驗儀器有限公司生產(chǎn)）；超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、PCR方法

提取籽鵝卵泡及腦垂體的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，通過RT-PCR擴增促卵泡素（FSH）、催乳素（PRL）、抑制素（INH）基因。

1.2.2 重組真核、原核表達載體構(gòu)建

將通過PCR獲得的FSH、PRL、INH基因與pMD18T載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中，擴增培養(yǎng)后使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，并將重組質(zhì)粒進行測序，將測序結(jié)果進行Blast比對。將酶切后的FSH、PRL、INH基因進行回收，將FSH基因與與pcDNA3.0載體相連接，PRL、INH基因與pET-32a載體連接，將重組pET-32a-PRL及pET-32a-INH載體轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細胞中，將重組pcDNA3.0-FSH轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中，擴增培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定后進行再次測序，將測序正確的重組質(zhì)粒放置于-80 ℃冰箱中留用。

1.2.3 PRL、INH蛋白表達及純化

對包含重組pET-32a-PRL及pET-32a-INH載體的BL21感受態(tài)細胞進行培養(yǎng)，加入IPTG誘導(dǎo)重組載體表達，用超聲波裂解儀破碎細菌進行SDS-PAGE電泳，檢測PRL、INH蛋白表達情況，然后將包含重組pET-32a-PRL及pET-32a-INH載體的BL21感受態(tài)細胞進行擴大化培養(yǎng)，超聲波裂解儀破碎細菌后收集蛋白，使用Ni層析柱進行蛋白純化，獲得純化蛋白后放置于-80 ℃冰箱中留用。

將包含重組pcDNA3.0-FSH載體的DH5α感受態(tài)細胞進行擴大化培養(yǎng)，使用質(zhì)粒大提試劑盒提取重組質(zhì)粒，放置于-80 ℃冰箱中留用。

1.2.4 免疫籽鵝

選取成年產(chǎn)蛋巔峰期籽鵝及產(chǎn)蛋初期的籽鵝進行免疫，將成功構(gòu)建的重組真核表達載體pcDNA3.0-FSH、純化的PRL、INH蛋白單獨及聯(lián)合免疫籽鵝，蛋白免疫劑量每次為100 μg，重組質(zhì)粒免疫劑量每次為10 μg，每組免疫30只籽鵝。

隔2周免疫1次，共免疫3次。

1.2.5 產(chǎn)蛋量觀察

觀察并統(tǒng)計免疫籽鵝及正常籽鵝的年產(chǎn)蛋數(shù)量、產(chǎn)蛋周期。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0及Excel對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)加減標準差（ ± ）表示，組間兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用LSD–t檢驗，當p＜0.05時，表示差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)蛋量情況

統(tǒng)計4組籽鵝接種免疫后1年內(nèi)產(chǎn)蛋量情況，結(jié)果顯示，4組籽鵝接種免疫后1年內(nèi)的產(chǎn)蛋量均較正常籽鵝有所增加，其中聯(lián)合免疫的產(chǎn)蛋巔峰期籽鵝、產(chǎn)蛋初期籽鵝及免疫INH的產(chǎn)蛋初期籽鵝的年產(chǎn)蛋量與正常籽鵝相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），詳細結(jié)果見表1。

表1 籽鵝產(chǎn)蛋量比較情況（ ）

表1 籽鵝產(chǎn)蛋量比較情況（ ）

PRL 81.05±2.48 82.04±2.69 INH 81.72±2.65 82.63±3.07*聯(lián)合免疫 82.91±3.18* 83.87±3.44*項目 產(chǎn)蛋巔峰期籽鵝 產(chǎn)蛋初期籽鵝 正常籽鵝FSH 80.47±2.23 81.61±2.64 79.62±2.69

2.2 產(chǎn)蛋周期情況

統(tǒng)計4組籽鵝接種免疫后1年內(nèi)產(chǎn)蛋周期情況，結(jié)果顯示，4組籽鵝接種免疫后1年內(nèi)的產(chǎn)蛋周期均較正常籽鵝有所增加，其中聯(lián)合免疫的產(chǎn)蛋巔峰期籽鵝、產(chǎn)蛋初期籽鵝及免疫INH的產(chǎn)蛋初期籽鵝的產(chǎn)蛋周期與正常籽鵝相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），詳細結(jié)果見表2。

表2 各組籽鵝產(chǎn)蛋周期情況（x ±s ）

3 討論

促卵泡素（FSH）是動物腦垂體前葉促性腺激素細胞（嗜堿性細胞）分泌的一種糖蛋白激素，對于雄性動物的精子發(fā)生，雌性動物卵泡的生長發(fā)育、成熟、排卵，乃至類固醇激素的合成都是極為重要的調(diào)節(jié)激素[4]。在生產(chǎn)實踐中主要用于動物的誘導(dǎo)發(fā)情和超數(shù)排卵，以及治療垂體和性腺機能障礙。催乳素（Prolactin，PRL）是垂體前葉嗜酸性細胞分泌的一種蛋白激素。對于哺乳動物，PRL能直接作用于卵巢顆粒細胞，抑制促卵泡激素(FSH)誘導(dǎo)的顆粒細胞芳香化酶活性，使雌二醇（E2）合成減少，并抑制排卵；禽類就巢期間，血液PRL含量明顯升高，黃體生成素（LH）和卵巢類固醇水平下降，卵巢萎縮，排卵停止。因此，PRL在卵泡發(fā)育中具有重要作用[5]。抑制素（inhibin, INH）是一種主要由雄性睪丸支持細胞（Sertoli2 like cells）和雌性卵巢顆粒細胞（granulosa cells）分泌的二聚體糖蛋白激素，目前家禽中只有雞抑制素和活化素各亞基序列已被測定。研究發(fā)現(xiàn)家禽INH和ACT與哺乳動物的同源性較高，在進化上比較保守，尤其是雞βA亞基C-端在進化上非常保守[6]。

本研究通過分子生物學(xué)手段，獲得影響籽鵝產(chǎn)蛋性能的促卵泡素、催乳素和抑制素基因，并通過降低籽鵝體內(nèi)催乳素和抑制素水平，延長籽鵝的產(chǎn)蛋時間和促進籽鵝FSH的分泌，提高籽鵝體內(nèi)FSH水平，以提高籽鵝的產(chǎn)蛋性能。