石 玲，王澤鋒，張 薇，閔 勇

(紅河學(xué)院理學(xué)院，云南 蒙自 661199)

烏骨藤，又名通關(guān)藤，系蘿藦科(Asclepiadaceae)牛奶菜屬植物通關(guān)藤(Marsdenia tenacissima)的藤莖。主要產(chǎn)于云南、貴州、廣西等地。藥用葉、藤，全年可采，其味苦、微寒，具有清熱解毒、止咳平喘、消炎鎮(zhèn)痛等功效，可用于治療肺炎、咳喘等。烏骨藤的主要化學(xué)成分為甾體皂苷、多糖、萜類化合物等[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，烏骨藤具有調(diào)節(jié)免疫功能和抗腫瘤作用[2—3]，以烏骨藤提取物制備而成的中藥消癌平對肺癌、肝癌等腫瘤具有明顯的抑制作用[4—5]，是一種有發(fā)展前景的抗癌中藥。近年來，從中藥材中提取抗腫瘤有效成分越來越受到關(guān)注。全世界已從多種中藥材中篩選出近萬種有效成分，推出了數(shù)十種抗腫瘤藥物。

白樺脂酸屬五環(huán)三萜類有機(jī)酸，存在于多種中藥材中，除有抗炎抑菌、降血脂及抗瘧疾等活性外，對黑素瘤、神經(jīng)外胚層及惡性腦腫瘤等多種腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈的毒殺效應(yīng)，而對正常細(xì)胞無殺傷力，同時其抗 HIV-1病毒活性強(qiáng)于部分現(xiàn)有臨床應(yīng)用藥物[6—9]，是治療艾滋病、腫瘤的新物質(zhì)?，F(xiàn)有提取分離白樺脂酸的方法多以二氯甲烷為提取溶劑，該方法不適于白樺脂酸的工業(yè)生產(chǎn)，限制了白樺脂酸的開發(fā)和利用。本研究建立了適合于烏骨藤中白樺脂酸的超聲提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白樺脂酸對照品(批號：MUST-13010404)，購自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；烏骨藤于2013年12月采自云南省紅河州屏邊縣，經(jīng)云南省紅河學(xué)院閔勇教授鑒定為蘿藦科植物通關(guān)藤的藤莖；乙腈為色譜純，其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

島津超高效液相色譜儀 LC-30A：LC-30AD×2輸液泵；DGU-20A5在線脫氣機(jī)；SIL-30AC自動進(jìn)樣器；CTO-30AC柱溫箱；CBM-20A系統(tǒng)控制器；LabSolution Ver.5.41色譜工作站；超聲波清洗器(SK5200HP，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(HH-S24，金壇市大地自動化儀器廠)；電子天平(CP224C，奧豪斯儀器(上海)有限公司)；化學(xué)分析濾紙；有機(jī)相濾膜。

1.2 色譜柱條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS柱(150×2.0 mm I.D，2.2 μm)；流動相：乙腈-水(80:20)；檢測波長：210 nm；流速：0.35 mL·min-1；柱溫 35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液制備

精密稱取適量白樺脂酸對照品，加甲醇溶解后配成0.70 mg·mL-1溶液，備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精密吸取 1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 mL濃度為0.70 mg·mL-1白樺脂酸對照品溶液，用甲醇定容至25 mL配成標(biāo)準(zhǔn)儲備液。以甲醇溶液為空白，按上述色譜柱條件進(jìn)行測定，以白樺脂酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 白樺脂酸提取

精密稱取0.50 g烏骨藤粉末，按一定的提取條件(超聲功率、提取時間、提取溶劑濃度、料液比和提取次數(shù))進(jìn)行超聲提取，過濾，收集濾液，回收溶劑至近干，用適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中定容，即得供試品溶液。

1.3.4 烏骨藤白樺脂酸含量測定

分別吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀測定。

1.4 實驗設(shè)計

1.4.1 單因素實驗

1.4.1.1 超聲功率

按照 1.3.3方法，固定乙醇濃度 50%，料液比(g/mL，下同) 1:10，提取時間5 min，以不同超聲功率(100、120、140、160、180 W)依次進(jìn)行超聲提取，考察超聲功率對白樺脂酸提取率的影響。

1.4.1.2 提取時間

按照 1.3.3方法，固定乙醇濃度 50%，料液比1:10，超聲功率140 W，設(shè)置不同提取時間(5、10、15、20、25 min)，考察其對白樺脂酸提取率的影響。

1.4.1.3 乙醇濃度

按照1.3.3方法，固定料液比為1:10，超聲功率140 W，提取時間20 min，依次改變乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)，考察乙醇濃度對白樺脂酸提取率的影響。

1.4.1.4 料液比

按照1.3.3方法，固定乙醇濃度80%，超聲功率140 W，提取時間20 min，改變料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)，考察其對白樺脂酸提取率的影響。

1.4.1.5 提取次數(shù)

按照1.3.3方法，固定乙醇濃度80%，超聲功率140 W，提取時間20 min，料液比為1:25，分別超聲提取1、2、3、4、5次，考察提取次數(shù)對白樺脂酸提取率的影響。

1.4.2 響應(yīng)曲面實驗設(shè)計

在單因素實驗基礎(chǔ)上，以80%乙醇為提取溶劑，選擇超聲功率(A)、提取時間(B)、料液比(C)和提取次數(shù)(D)作為響應(yīng)面設(shè)計的四個因素，利用 Design Expert 8.06軟件的中心組合試驗Box-Behnken分析優(yōu)化烏骨藤中白樺脂酸的提取條件。每個自變量的低、中、高實驗水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，以白樺脂酸提取率為響應(yīng)值(Y)，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)曲面分析實驗[10—11]。因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素及水平Table 1 Factors and levels in Box-Behnke design

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以白樺脂酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到白樺脂酸的回歸方程為：Y=1.213×106X+651.43，r=0.9996。結(jié)果表明，白樺脂酸在0.028～0.560 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 單因素對白樺脂酸提取效果的影響

2.2.1 超聲功率

從圖1: A可知，隨著超聲功率的增大，白樺脂酸提取率先增大后稍微降低，在140 W時提取率最高。這是當(dāng)功率增加時超聲產(chǎn)生空化作用有利于白樺脂酸溶出，但功率過大時，因空化作用過強(qiáng)而產(chǎn)生大量氣泡增加散射衰減形成空化屏障，且容器內(nèi)發(fā)生局部瞬時升溫，削弱超聲提取效果，從而降低白樺脂酸提取率[12]。因此，超聲功率140 W為最佳。

2.2.2 提取時間

圖1: B顯示，隨著提取時間的增加，白樺脂酸提取率先逐漸增大后趨于不變。其原因可能是隨著提取時間的延長，烏骨藤中的白樺脂酸幾乎全部溶出，再增加提取時間提取率沒有提高，且增加成本，故提取時間20 min為最佳。

2.2.3 乙醇濃度

由圖1: C可知，隨著乙醇濃度的增加，白樺脂酸提取率呈先升后降的趨勢。當(dāng)乙醇濃度為80%時，烏骨藤中的白樺脂酸提取率最高，乙醇濃度再增大時提取率開始降低。這是由于乙醇濃度不同導(dǎo)致浸提溶劑極性大小不同，因此對白樺脂酸的溶出效果有一定影響，同時，這可能也與烏骨藤中所含白樺脂酸化合物的性質(zhì)有關(guān)[13]。因此，適宜烏骨藤白樺脂酸提取的乙醇濃度為80%。

圖1 單因素對白樺脂酸提取率的影響Fig. 1 Effects of single factor on the extraction rate of betulinic acid

2.2.4 料液比

料液比對白樺脂酸提取率的影響如圖1: D所示。隨著料液比不斷增大，白樺脂酸提取率逐漸增加，當(dāng)料液比增至1：25時，白樺脂酸提取率已基本達(dá)到最大值，繼續(xù)增加料液比白樺脂酸提取率變化不大。隨著提取溶劑的增加，烏骨藤與溶劑的接觸面積增大，從而有利于白樺脂酸溶出，當(dāng)料液比增加到一定程度時，白樺脂酸已經(jīng)基本提取完全。因此，適宜提取的料液比為1:25。

2.2.5 提取次數(shù)

由圖1: E可知，隨著提取次數(shù)的增加，提取率也隨之增加，但提取兩次以后，提取率升高不明顯。說明提取兩次后烏骨藤的白樺脂酸已基本被提盡，再增加提取次數(shù)會浪費(fèi)溶劑用量及增大蒸發(fā)濃縮負(fù)荷，所以選擇提取次數(shù)為2次。

2.3 響應(yīng)曲面分析優(yōu)化工藝

2.3.1 白樺脂酸提取率擬合回歸模型建立

采用 Design Expert 8.06軟件的中心組合試驗Box-Behnken進(jìn)行實驗設(shè)計考察，以白樺脂酸提取率為響應(yīng)值，結(jié)果見表2。

表2 Box-Benhnken試驗方案及其提取率Table 2 Box-Behnken design with experimental results

采用響應(yīng)曲面法分析實驗結(jié)果，對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式回歸擬合，得到回歸方程如下：

其中，Y為白樺脂酸提取率；A為超聲功率；B為提取時間；C為料液比；D為提取次數(shù)

2.3.2 方差顯著性分析

應(yīng)用回歸分析對方程各個因子進(jìn)行方差分析。由表3可知，以白樺脂酸提取率為響應(yīng)值，回歸方程的顯著性P<0.0001，說明該二次方程模擬極顯著，回歸方程模型與實驗擬合性較好，實驗誤差較小，可用于烏骨藤白樺脂酸提取率的分析和預(yù)測[14—15]。模型決定系數(shù)R2=0.9880，說明響應(yīng)值(白樺脂酸提取率)的變化有98.80%來源于所選變量，即超聲功率、提取時間、料液比、提取次數(shù)。回歸方程中各個變量對響應(yīng)值影響的顯著性由F檢驗判斷，P值越小，則變量影響越顯著。A、C、D、AB、BC、BD、CD、A2、B2、C2、D2對白樺脂酸提取率有極顯著影響，AD對白樺脂酸提取率有顯著影響(表3)。

2.3.3 烏骨藤中白樺脂酸提取工藝的響應(yīng)面分析

影響烏骨藤中白樺脂酸提取率的四個因素(超聲功率、提取時間、料液比和提取次數(shù))之間交互作用的效果如圖 2所示，6個響應(yīng)曲面的投影等高線最小橢圓的中心均落在所選的范圍內(nèi)，響應(yīng)值(烏骨藤白樺脂酸提取率)在4個因子設(shè)計的范圍內(nèi)呈現(xiàn)極大值。由圖2: a可知，烏骨藤白樺脂酸提取率隨超聲功率的增大以及提取時間的延長而增大，到達(dá)兩因素的最佳編碼值出現(xiàn)最大值。由圖2: b可知，白樺脂酸提取率隨超聲功率和料液比的變化而變化，超聲功率增加，提取率先增大后趨于平緩。由圖2: c可知，提取率隨超聲功率和提取次數(shù)的變化而變化，超聲功率增大，提取率先增加后減小，且變化幅度較大，提取率隨提取次數(shù)增大至最大值后減小，但變化幅度不大。由圖2: d～f可知，提取時間與料液比、提取時間與提取次數(shù)、料液比與提取次數(shù)之間的交互作用顯著，表現(xiàn)為曲面較陡[16]。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the quadratic polynomial model

圖 2 提取時間、超聲功率、料液比、提取次數(shù)對白樺脂酸提取率影響的響應(yīng)面圖Fig. 2 Response surface plots of the effect of extraction time, ultrasonic power, liquid-material ratio, times of extraction on the yield of betulinic acid

2.4 最佳提取條件

采用Design Expert 8.06軟件進(jìn)行分析，得到烏骨藤中白樺脂酸的最佳提取工藝為：超聲功率150.30 W，提取時間19.69 min，料液比1:25.61，提取2.32次，其白樺脂酸提取率為0.314%。為了驗證響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件提取白樺脂酸，考慮到實際操作的便利，將提取工藝調(diào)整為：超聲功率150 W，提取時間20 min，料液比為1:25，提取2次。采用高效液相色譜法對烏骨藤中白樺脂酸含量進(jìn)行測定，圖3: A為白樺脂酸標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖，圖3: B為白樺脂酸提取液的高效液相色譜圖，得到的白樺脂酸提取率為0.311%，其相對誤差小于1%，該工藝合理可行。

圖 3 白樺脂酸高效液相色譜圖Fig. 3 High performance liquid chromatography of betulinic acid

3 結(jié)論

本研究以乙醇為提取溶劑，提取烏骨藤中的白樺脂酸。首先進(jìn)行單因素實驗，分別考察了超聲功率、提取時間、乙醇濃度、料液比及提取次數(shù)對白樺脂酸提取率的影響。在單因素實驗基礎(chǔ)上，通過Design Expert 8.06軟件中的Box-Behnken中心組合設(shè)計進(jìn)行四因素(超聲功率、提取時間、料液比和提取次數(shù))三水平響應(yīng)曲面實驗，并對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析優(yōu)化，從而得到白樺脂酸的最佳提取工藝。結(jié)果顯示，烏骨藤中白樺脂酸以80%乙醇為提取溶劑的最佳提取工藝為：超聲功率150 W，提取時間20 min，料液比為1:25，提取2次。在此條件下，白樺脂酸提取率為0.311%。因此，利用響應(yīng)面分析方法對烏骨藤中白樺脂酸超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化合理可行，可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，能有效減少工藝操作的盲目性，從而為烏骨藤中白樺脂酸進(jìn)一步的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。