王 玲，郭小權(quán)，胡國良，劉 佩，黃 橙，李 麟，李谷月，程素芳，阮業(yè)召，李慶慶，陳盈盈，劉 平*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物群發(fā)性疾病監(jiān)測(cè)與防治研究所/江西省畜禽疫病診斷與防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 科技園，江西 南昌330045）

【研究意義】奶牛乳房炎是一種由病原微生物、物理損傷等多種因素造成的一種奶牛乳房炎性疾病，該病導(dǎo)致的主要病理變化為乳房實(shí)質(zhì)、間質(zhì)發(fā)生炎癥，乳汁中成分發(fā)生改變，嚴(yán)重影響乳汁的產(chǎn)量和乳制品質(zhì)量，進(jìn)而對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也危害人類食品健康安全?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】天津地區(qū)的奶牛乳房炎流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，隱形乳房炎的發(fā)病率為50.72%[1]。郝景鋒等[2]對(duì)吉林長(zhǎng)春多個(gè)奶牛場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)乳房炎的發(fā)病率高達(dá)57.21%，羅金印等[3]對(duì)蘭州地區(qū)奶牛乳房炎發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查分析，結(jié)果顯示奶牛隱性乳房炎的頭陽性率為58.43%。有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年奶牛乳房炎的發(fā)病率平均高達(dá)50%，美國、英國等發(fā)達(dá)國家奶牛乳房炎的發(fā)病率平均在40%左右[4]。奶?；既榉垦缀髸?huì)引起牛奶的產(chǎn)量和質(zhì)量下降，直接引起重大經(jīng)濟(jì)損失。在我國，每年因奶牛乳房炎造成的經(jīng)濟(jì)損失在150～450億元[5]，因此，奶牛乳房炎的預(yù)防和治療應(yīng)該引起人們的重視?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】引起奶牛乳房炎的病因有很多，其中主要原因?yàn)椴≡⑸锔腥?。目前，引起奶牛乳房炎的主要致病菌?種：葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌和酵母樣真菌[7]。除病原微生物外，有研究稱，溫度、濕度等環(huán)境因素與奶牛乳房炎的發(fā)病率有很大的關(guān)系[8]。而廣西位于我國的亞熱帶地區(qū)，該地區(qū)溫度高濕度大?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)結(jié)合環(huán)境及衛(wèi)生情況對(duì)廣西某奶牛場(chǎng)奶牛乳房炎發(fā)病率進(jìn)行調(diào)查以及對(duì)病原菌進(jìn)行分離鑒定，為今后進(jìn)行藥物敏感性分析提供依據(jù)，也為該地區(qū)奶牛乳房炎的防治提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地區(qū)及動(dòng)物

本研究選取的奶牛場(chǎng)位于廣西南寧（東經(jīng)108.22°，北緯22.48°），該地1985年至2014年平均降雨量1 180.3 mm，平均氣溫20.47℃，平均相對(duì)濕度79.07%（數(shù)據(jù)來自廣西壯族自治區(qū)氣象科學(xué)數(shù)據(jù)共享服務(wù)中心）。該場(chǎng)約有1 000頭荷斯坦奶牛，當(dāng)奶?；加信R床或隱性乳腺炎時(shí)，一般采用抗生素治療，包括青霉素、鏈霉素和慶大霉素等。

1.2 奶牛乳房炎發(fā)病率調(diào)查

本試驗(yàn)通過加州乳房炎測(cè)試法（california mastitis test，CMT）檢測(cè)奶牛乳汁中體細(xì)胞數(shù)，對(duì)奶牛乳房炎進(jìn)行診斷，以此調(diào)查奶牛乳房炎的發(fā)病率。

1.3 樣品的收集

對(duì)廣西某奶牛場(chǎng)37頭奶牛，在無菌的條件下進(jìn)行人工取奶，牛奶樣品置于15 mL的滅菌離心管中，立即冷藏保存，后送至江西農(nóng)業(yè)大學(xué)臨床獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室4℃保存待用。

1.4 培養(yǎng)基及主要試劑

沙氏瓊脂培養(yǎng)基，改良馬丁培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基（Luria-Bertani培養(yǎng)基），LA培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基固體形式），伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，革蘭氏染色劑。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 真菌的培養(yǎng)與純化 取適量無菌采集的乳樣用三角玻璃棒凃板接種到沙氏瓊脂培養(yǎng)基上，置于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h左右，用勾菌環(huán)選取圓形典型菌落，劃線接種于新的沙氏瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12 h后革蘭氏染色，初步鑒定為真菌后送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行18S rRNA測(cè)序鑒定。

1.5.2 細(xì)菌的培養(yǎng)與純化 取適量無菌采集的乳樣用玻璃棒凃板接種到LA培養(yǎng)基上，置于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h左右，用勾菌環(huán)選取圓形典型菌落，劃線接種于新的LA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12 h后革蘭氏染色，初步鑒定為細(xì)菌形態(tài)后，送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行16S rRNA測(cè)序鑒定。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 奶牛場(chǎng)環(huán)境

經(jīng)調(diào)查該牛場(chǎng)奶牛乳房炎的發(fā)病率與胎次、年齡關(guān)系相關(guān)性較低，各胎次與年齡均有發(fā)生，牛場(chǎng)內(nèi)泥濘潮濕、飼喂方式不規(guī)范、環(huán)境衛(wèi)生較差（圖1）。主要用藥有頭孢噻呋鈉，林可霉素，慶大霉素，青霉素，鏈霉素等。

圖1 奶牛場(chǎng)內(nèi)環(huán)境Fig.1 Environment of dairy farm

2.2 奶牛場(chǎng)發(fā)病情況

本試驗(yàn)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2013—2018年，該奶牛場(chǎng)臨床型奶牛乳房炎的發(fā)病率為8.3%（圖2），隱性乳房炎在干奶前檢測(cè)，患病乳區(qū)占總?cè)閰^(qū)數(shù)的40%。

圖2 臨床型乳房炎發(fā)病率Fig.2 Incidence rate of clinical mastitis

2.3 臨床癥狀觀察

患有奶牛乳房炎的奶牛，乳房單側(cè)腫脹不對(duì)稱，乳頭發(fā)紅，觸摸溫度較高（圖3）。牛奶中含有乳凝塊（見圖4）。

2.4 病原菌培養(yǎng)結(jié)果

在沙氏瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可見乳白色單個(gè)圓形菌落（圖5）。經(jīng)革蘭氏染色，在油鏡下可觀察到不同大小的南瓜子樣菌體（圖6）。

圖3 患病奶牛乳房腫脹Fig.3 Swollen breasts of sick cows

圖4 牛奶中乳凝塊Fig.4 Milk clot in milk

圖5 真菌培養(yǎng)結(jié)果Fig.5 The results of fungal culture

圖6 真菌革蘭氏染色結(jié)果（1 000×）Fig.6 The results of fungal Gram staining（1 000×）

LA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)可見乳白色圓形單個(gè)菌落，伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基培養(yǎng)可見有的呈金屬光澤的圓形菌落，有的為乳白色圓形菌落（圖7）。革蘭氏染色觀察可見粉色短桿狀或球狀菌體（圖8）。

圖7 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果Fig.7 The results of bacterial culture

圖8 細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果（1 000×）Fig.8 The results of bacterial Gram staining（1 000×）

2.5 真菌的分離與鑒定

采集的37份奶樣中，共分離得到真菌52株，將分離得到的真菌進(jìn)行18S rRNA測(cè)序。結(jié)果顯示，假絲酵母菌有38株占73.1%，畢赤酵母菌占25%，其中熱帶念珠菌最多有20株占38.5%。

表1 真菌分離鑒定結(jié)果Tab.1 The results of isolation and identification of fungi

2.6 細(xì)菌的分離與鑒定

本試驗(yàn)從采集的37株乳樣中，分離得到細(xì)菌22株，進(jìn)行16S rRNA測(cè)序。結(jié)果顯示，克雷伯菌占54.5%，腸桿菌31.8%，大腸桿菌占22.7%，鏈球菌9.1%，葡萄球菌4.5%。

表2 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果Tab.2 The results of isolation and identification of bacteria

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該奶牛場(chǎng)自2013年以來，臨床型乳房炎的發(fā)病率在7.8%～8.5%，而隱性乳房炎的乳區(qū)發(fā)病率高達(dá)40%，雖然一直使用頭孢噻呋鈉，林可霉素，慶大霉素，青霉素，鏈霉素等抗生素進(jìn)行治療，但效果不明顯，可能是病原微生物的抗藥性增強(qiáng)導(dǎo)致。有研究稱，隱性乳房炎的發(fā)病受環(huán)境衛(wèi)生、飼養(yǎng)管理以及擠奶的方式等的影響[9]。筆者推測(cè)，該場(chǎng)隱性乳房炎的高發(fā)病率可能與場(chǎng)內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生條件、飼養(yǎng)管理方式有關(guān)。因此，正確的擠奶方式、良好的環(huán)境衛(wèi)生對(duì)減少乳房炎的發(fā)生有著關(guān)鍵作用。

本研究對(duì)患病奶牛的乳樣進(jìn)行病原菌分離鑒定，主要檢測(cè)出的病原菌有熱帶念珠菌、大腸桿菌和鏈球菌，其中大腸桿菌、熱帶念珠菌及乳房鏈球菌均為環(huán)境性病原微生物。而該牛場(chǎng)位于高溫高濕的廣西，場(chǎng)內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生條件較差，這可能是環(huán)境性病原菌增殖的主要原因。因此，在奶牛乳房炎的防治過程中，提高飼養(yǎng)管理水平，注意環(huán)境衛(wèi)生，及時(shí)清理牛舍糞便，定期消毒，規(guī)范飼喂等對(duì)預(yù)防乳房炎的發(fā)生至關(guān)重要。

在分離得到的病原菌中，假絲酵母菌的分離率高達(dá)73.1%，其中熱帶念珠菌最多。有研究報(bào)道，在全球范圍內(nèi)，熱帶念珠菌的分布具有明顯的地域差異[10-11]，在赤道附近的南亞地區(qū)，受熱帶環(huán)境、溫度、濕度的影響，熱帶念珠菌的感染率較高[12]。另外，抗生素的大量使用，也有可能促進(jìn)真菌的生長(zhǎng)[1-14]。而廣西高溫高濕的亞熱帶氣候特點(diǎn)，以及奶牛場(chǎng)長(zhǎng)期使用抗生素，都有可能促進(jìn)假絲酵母菌的增殖，使熱帶念珠菌的感染率增加。

因此，在奶牛乳房炎的防治過程中，應(yīng)注意防重于治。搞好環(huán)境衛(wèi)生，及時(shí)清理糞便異物，定期進(jìn)行消毒，增強(qiáng)飼養(yǎng)管理。治療時(shí)，應(yīng)分析其致病原因，定期檢測(cè)藥物敏感性，合理配伍用藥，避免濫用抗生素。