蔡 蕤

（鄭州市第七人民醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州450000）

肝癌是世界常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015 年全球肝癌發(fā)病率為85萬(wàn)，死亡率為81 萬(wàn)（高居世界惡性腫瘤第2 位），其中，乙型肝炎病毒感染和酗酒是引起肝癌患者死亡的主要原因［2-3］。雖然肝癌的臨床治療有手術(shù)、放療、化療、免疫治療等多種形式，但其發(fā)病隱匿、易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率高，且放、化療治療不良反應(yīng)較大，在改善肝癌患者生存率方面仍面臨巨大挑戰(zhàn)［4-5］。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥療法是我國(guó)的特色治療方式，應(yīng)用范圍廣［6］。靈芝Ganoderma Lucidum是我國(guó)的一種傳統(tǒng)名貴藥材，具有補(bǔ)益五臟、止咳平喘、養(yǎng)肝護(hù)肝、補(bǔ)氣安神的功效［7］。靈芝三萜是靈芝的主要成分之一，常用于腫瘤的輔助治療［8］。已有研究［9］表明，靈芝三萜能夠增強(qiáng)紫杉醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制和凋亡的作用，抑制異種移植瘤生長(zhǎng)。本研究通過(guò)研究靈芝三萜對(duì)HepG2 人肝癌細(xì)胞增殖、凋亡及Wnt／β-catenin 信號(hào)通路的影響，探討靈芝三萜預(yù)防及治療肝癌的作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 HepG2 人肝癌細(xì)胞（批號(hào)HB-8065） 購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保存所。

1.2 藥物與試劑 靈芝三萜（純度為99 %） 購(gòu)自杭州甫洛生物科技有限公司，溶解于二甲基亞砜；胎牛血清（批號(hào)12483012）、胰蛋白酶（批號(hào)20230）、二甲基亞砜（批號(hào)TS-20688） 購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)液（批號(hào)21875-091） 購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；XAV-939 通路抑制劑（批號(hào)S1180） 購(gòu)自美國(guó)Selleck Chemicals 公司；LiCl 通路激活劑（批號(hào)A100416） 購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；Annexin V-FITC／PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)40302ES20） 購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；雙蒸水ddH2O （批號(hào)PER 018-1） 購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；PVDF 膜（批號(hào)BSP0161）、BCA 試劑盒（批號(hào)PC0020）、RIPA 裂解液（批號(hào)R0020） 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；MTT （批號(hào)M2129） 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；兔抗人p-GSK-3β多克隆抗體（批號(hào)SC-11757）、兔抗人βcatenin 多克隆抗體（批號(hào)NBP1-32239）、兔抗人GAPDH多克隆抗體（批號(hào)LS-C108027）、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)36208ES60） 購(gòu)自上海煊翎生物科技有限公司；兔抗人c-myc多克隆抗體（批號(hào)EPR17924）、兔抗人cyclin D1多克隆抗體（批號(hào)EPR2241）、兔抗人caspase-3 多克隆抗體（批號(hào)ab13847）、兔抗人caspase-8 多克隆抗體（批號(hào)ab25901） 購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。

1.3 儀器 MCO-18AC 型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自日本SANYO 公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司；HBS-1096B 型酶標(biāo)儀購(gòu)自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10 % 胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液于37 ℃、5 %CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，每隔2 d 換液1 次。

2.2 MTT 檢測(cè)

2.2.1 不同濃度靈芝三萜對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的影響 待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，收集HepG2 細(xì)胞，胰酶消化并重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106／mL 并接種至96 孔板。將細(xì)胞分為靈芝三萜低、中、高劑量組（10、50、100 μg／mL），按不同分組加入靈芝三萜處理HepG2 細(xì)胞24、48、72 h，加入20 μL質(zhì)量濃度為5 mg／mL 的MTT，繼續(xù)孵育4 h；棄去多余培養(yǎng)基，加入150 μL 二甲基亞砜振蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處吸光度值（OD）。每組6 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5 次。

2.2.2 靈芝三萜通過(guò)Wnt／β-catenin 信號(hào)通路影響HepG2細(xì)胞增殖 待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，收集HepG2 細(xì)胞，胰酶消化并重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106／mL 并接種至96 孔板。將細(xì)胞 分為對(duì)照組 （DMSO）、靈芝三萜組（100 μg／mL）、XAV-939 組（20 μmol／L 抑制劑）、LiCl 組（20 mmol／L 激活劑）、靈芝三萜+ddH2O 組（100 μg／mL+ddH2O）、靈芝三萜+LiCl 組（100 μg／mL+20 mmol／L 激活劑）；細(xì)胞分別按不同分組加入藥物處理24、48、72 h，MTT 處理按照“2.2.1” 項(xiàng)下MTT 處理方法。每組6 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5 次。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

2.3.1 不同濃度靈芝三萜對(duì)HepG2 細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響 按照“2.2.1” 項(xiàng)下分組處理細(xì)胞，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h 后，加入胰酶消化，于4 ℃、300g條件下離心，收集細(xì)胞，利用Annexin V-FITC／PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，依次加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI，輕輕混勻后于室溫避光孵育15 min，置流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2.3.2 靈芝三萜通過(guò)Wnt／β-catenin 信號(hào)通路影響HepG2細(xì)胞凋亡 按照 “2.2.2” 項(xiàng)下分組處理細(xì)胞，按照“2.3.1” 項(xiàng)下流式細(xì)胞儀術(shù)方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2.4 Western blot 檢測(cè) 按照“2.2.2” 項(xiàng)下對(duì)照組、靈芝三萜組分組，細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h，使用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液置于冰上進(jìn)行裂解，4 ℃、12 000g離心20 min，以提取蛋白。通過(guò)BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取40 μg 蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。電泳結(jié)束后將蛋白樣品電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，將膜在含5 % 脫脂奶粉的TBST 液中室溫封閉1 h；之后分別加入兔抗人c-myc 多克隆抗體（1 ∶1 000）、兔抗人cyclinD1 多克隆抗體（1 ∶1 000）、兔抗人caspase-3 多克隆抗體（1 ∶500）、兔抗人caspase-8 多克隆抗體 （1 ∶ 500）、兔抗人p-GSK-3β 多克隆抗體（1 ∶500）、兔抗人β-catenin 多克隆抗體（1 ∶500）、兔抗人GAPDH 多克隆抗體（1 ∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜；膜洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP） 標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h；用TBST 洗膜，ECL 試劑盒顯示條帶。以GAPDH 為內(nèi)參，檢測(cè)蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度靈芝三萜對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的影響 不同濃度靈芝三萜分別作用HepG2 細(xì)胞24、48、72 h，靈芝三萜抑制HepG2 細(xì)胞增殖（P＜0.05），且濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度靈芝三萜對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的影響（， n＝5）

表1 不同濃度靈芝三萜對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的影響（， n＝5）

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05；與靈芝三萜低劑量組比較，#P＜0.05；與靈芝三萜中劑量組比較，△P＜0.05。

3.2 不同濃度靈芝三萜對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，靈芝三萜組細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05），且濃度越高，細(xì)胞凋亡越多，見(jiàn)表2。100 μg／mL 靈芝三萜對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的抑制作用和細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用最強(qiáng)，選取100 μg／mL靈芝三萜進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 不同濃度靈芝三萜對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡的影響（， n＝5）

表2 不同濃度靈芝三萜對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡的影響（， n＝5）

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05；與靈芝三萜低劑量組比較，#P＜0.05；與靈芝三萜中劑量組比較，△P＜0.05。

3.3 靈芝三萜對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，靈芝三萜（100 μg／mL）作用HepG2細(xì) 胞 24、48、72 h，c-myc、cyclinD1 蛋白表 達(dá)下調(diào)（P＜0.05），caspase-3、caspase-8 蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖1、表3。

3.4 靈芝三萜對(duì)Wnt／β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，靈芝三萜 （100 μg／mL） 作用HepG2 細(xì)胞24、48、72 h，β-catenin、p-GSK-3β 蛋白表達(dá)下調(diào) （P＜0.05）。提示100 μg／mL 靈芝三萜可能影響HepG2 細(xì)胞中Wnt／β-catenin 信號(hào)通路。見(jiàn)圖2、表4。

圖1 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白

3.5 Wnt／β-catenin 信號(hào)通路對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖、凋亡的影響 20 μmol／L XAV-939 干預(yù)HepG2 細(xì)胞24、48、72 h，抑制HepG2 細(xì)胞增殖（P＜0.05），促進(jìn)細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05）；而20 mmol／L LiCl 干預(yù)HepG2 細(xì)胞24、48、72 h，促進(jìn)HepG2 細(xì)胞增殖（P＜0.05），抑制細(xì)胞凋亡率（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

3.6 靈芝三萜通過(guò)Wnt／β-catenin 信號(hào)通路影響HepG2 細(xì)胞增殖、凋亡 單獨(dú)以100 μg／mL 靈芝三萜作用HepG2 細(xì)胞24、48、72 h 能明顯抑制細(xì)胞增殖（P＜0.05），并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（P＜0.05）；而100 μg／mL 靈芝三萜聯(lián)合20 mmol／LLiCl 干預(yù)HepG2 細(xì)胞24、48、72 h，細(xì)胞存活較靈芝三萜+ddH2O 組升高 （P＜0.05），同時(shí)細(xì) 胞凋亡 率降低（P＜0.05）。見(jiàn)表6。

表3 靈芝三萜對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（， n＝5）

表3 靈芝三萜對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（， n＝5）

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05。

圖2 Western blot 檢測(cè)各組β-catenin、p-GSK-3β 蛋白

4 討論

肝癌的發(fā)病率占世界惡性腫瘤的第6 位，其中我國(guó)肝癌患者占一半以上［10］。肝癌的發(fā)生與酗酒、丙型肝炎病毒感染、乙型肝炎病毒感染、身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、糖尿病等因素有關(guān)，肝炎病毒疫苗接種、肝臟疾病早期篩查、使用中草藥增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能等方式能有效預(yù)防肝癌的發(fā)生［11-13］。靈芝三萜具有降血糖、降血脂、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤等藥理作用，可由擔(dān)子菌門(mén)、傘菌綱、靈芝科靈芝中提?。?4］。迄今為止，已有400 多個(gè)化合物從靈芝中分離并鑒定，其中150 多個(gè)為三萜類(lèi)化合物，靈芝三萜是靈芝提取物中的主要活性成分［15-17］。有文獻(xiàn)［18］報(bào)道，靈芝三萜能夠阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成，從而發(fā)揮抑癌作用。Yue 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，靈芝三萜通過(guò)參與細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激、鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過(guò)程在宮頸癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用；同時(shí)，Thyagarajan 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，靈芝三萜能夠調(diào)節(jié)自噬效應(yīng)蛋白Beclin 1 表達(dá)，抑制p38 絲裂原活化蛋白激酶磷酸化，用于結(jié)腸癌的臨床治療。本研究低、中、高劑量的靈芝三萜均能有效抑制HepG2 人肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且濃度越高、抑制或誘導(dǎo)作用越強(qiáng)。

表4 靈芝三萜對(duì)β-catenin、p-GSK-3β 蛋白表達(dá)的影響（， n＝5）

表4 靈芝三萜對(duì)β-catenin、p-GSK-3β 蛋白表達(dá)的影響（， n＝5）

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05。

表5 Wnt／β-catenin 信號(hào)通路對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖和凋亡的影響（， n＝5）

表5 Wnt／β-catenin 信號(hào)通路對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖和凋亡的影響（， n＝5）

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05。

表6 靈芝三萜通過(guò)Wnt／β-catenin 信號(hào)通路對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖、凋亡的影響（， n＝5）

表6 靈芝三萜通過(guò)Wnt／β-catenin 信號(hào)通路對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖、凋亡的影響（， n＝5）

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05；與靈芝三萜+ddH2O 組比較，#P＜0.05。

Wnt 信號(hào)通路自20 世紀(jì)80 年代被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已成為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，包括經(jīng)典Wnt （Wnt／β-catenin） 信號(hào)通路和非經(jīng)典信號(hào)通路，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等 過(guò)程中 起重要作用［21］。β-catenin 是Wnt／βcatenin 信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，Wnt 蛋白與卷曲蛋白（Fzd）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5／6 或糖原合成酶激酶3β （GSK-3β） 等跨膜受體結(jié)合，將Wnt 信號(hào)傳遞至胞質(zhì)蛋白，使β-catenin 由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與T 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子／淋巴樣增強(qiáng)因子等核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而激活c-myc、細(xì)胞周期蛋白D1 （cyclin D1）、半胱氨酸蛋白酶（caspase）等下游靶基因［22-24］。Wnt／β-catenin 信號(hào)通路與結(jié)直腸癌、胃癌等多種腫瘤發(fā)展有關(guān)。據(jù)報(bào)道，GSK-3β、β-catenin 在結(jié)直腸癌組織中異常表達(dá)，調(diào)節(jié)GSK-3β、β-catenin 表達(dá)水平可抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［25］；激活Wnt／β-catenin 信號(hào)通路則促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，與胃癌預(yù)后不良有關(guān)［26］。本研究，100 μg／mL 靈芝三萜能夠上調(diào)HepG2 細(xì)胞中caspase-3、caspase-8 蛋白表達(dá)并下調(diào)c-myc、cyclinD1、β-catenin 和p-GSK-3β 蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡。20 μmol／L XAV-939 干預(yù)能抑制HepG2 細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡，而20 mmol／L LiCl 干預(yù)則結(jié)果相反。使用20 mmol／L LiCl 干預(yù)能在一定程度上減弱靈芝三萜對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。

綜上所述，靈芝三萜能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)Wnt／β-catenin 信號(hào)通路調(diào)節(jié)下游靶標(biāo)c-myc、cyclinD1、caspase-3、caspase-8 表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。