尚念勝 牛燕英

[摘要]目的：探討A型肉毒毒素對人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（Human keloid fibroblasts，HKF）生物學(xué)行為和TGF-β/Smad信號通路和ERK信號通路表達(dá)的影響。方法：在HKF培養(yǎng)過程中加入A型肉毒毒素進(jìn)行干擾，觀察A型肉毒毒素對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞TGF-β/Smad通路和ERK通路相關(guān)分子的變化及細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡情況。結(jié)果：A型肉毒毒素可以抑制HKF增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)凋亡，并且明顯抑制Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白、α-SMA和CTGF基因的表達(dá)水平，上調(diào)IFN-γ、TGF-β3基因的表達(dá)水平。上調(diào)Smad7基因和蛋白的表達(dá)，下調(diào)VEGF基因表達(dá)，明顯抑制p-Smad2和p-Smad3蛋白表達(dá)水平，并且抑制P-ERK1/2蛋白表達(dá)。以上生物學(xué)變化均且呈藥物濃度依賴性。結(jié)論：A型肉毒毒素可抑制HKF的增殖、侵襲、血管生成和膠原積累，這些效應(yīng)與TGF-β/Smad和ERK1/2信號通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]瘢痕疙瘩;A型肉毒毒素;人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞;ERK信號通路;TGF-β/Smad通路;細(xì)胞增殖;細(xì)胞遷移;細(xì)胞侵襲

[中圖分類號]R619+.6 ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A ? ?[文章編號]1008-6455（2020）05-0104-06

Abstract： Objective ?To investigate the effects of botulinum toxin type A on the biological behavior of human keloid fibroblasts （HKF） and the expression of TGF-β/Smad and ERK signaling pathways. Methods ?Botulinum toxin type A was added to HKF culture to interfere with the changes of TGF-β/Smad pathway and ERK pathway related molecules， cell proliferation， invasion and apoptosis of keloid fibroblasts. Results ?Botulinum toxin type A could inhibit the proliferation， migration and invasion of HKF， promote apoptosis， and significantly inhibit the expression levels of collagen type Ⅰ， collagen type Ⅲ， fibronectin， α-SMA and CTGF genes， and up-regulate the expression levels of IFN-γ and TGF-β3 genes. Botulinum toxin type A can significantly up-regulate the expression of Smad7 gene and protein in TGF-β/Smad pathway， down-regulate the expression of VEGF gene， significantly inhibit the expression of p-Smad2 and p-Smad3 protein， and inhibit the expression of P-ERK1/2 protein. The above biological changes were dose-dependent. Conclusion ?Botulinum toxin ?type A can inhibit the proliferation， invasion， angiogenesis and collagen accumulation of HKF in a dose-dependent manner. These effects are related to TGF-β/Smad and ERK1/2 signaling pathways.

Key words： keloid; botulinum toxin type A; human keloid fibroblasts; ERK signaling pathway; TGF-β/Smad pathway; cell proliferation; cell migration; cell invasion

瘢痕疙瘩是整形外科難治性疾病之一，既影響了皮膚外觀和功能，也給患者帶來極大痛苦[1]。目前，瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制尚未明了，臨床上多采用局部藥物治療、手術(shù)和激光治療等綜合措施，但是效果不甚理想[2]。A型肉毒毒素治療增生性瘢痕的效果較好，但是其治療機(jī)制尚未明確，可能與抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖和促進(jìn)凋亡有關(guān)[3-5]。TGF-β/Smad信號通路可參與瘢痕疙瘩的形成[6]。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Extracellular signal-regulated kinase，ERK）是傳遞絲裂原信號的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，可參與細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞骨架的構(gòu)建等多種生物學(xué)反應(yīng)[7]。ERK信號通路同樣在調(diào)節(jié)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為中有重要作用[8]。本研究以人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（Human keloid fibroblasts，HKF）為研究對象，檢測了A型肉毒毒素干預(yù)后HKF的增殖、凋亡、遷移和TGF-β/Smad信號通路及ERK信號通路表達(dá)水平的變化，旨在探討A型肉毒毒素治療瘢痕疙瘩的機(jī)制。

1 ?材料和方法

1.1 細(xì)胞及培養(yǎng)：HKF購于上海雅吉生物科技有限公司，含10%胎牛血清的DMEM-1640培養(yǎng)液（上海恒斐生物科技有限公司）進(jìn)行培養(yǎng)，條件為37℃、5% CO2。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞活力測定：細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒購于上海新睿生物有限公司。HKF（1×104個/ml）接種于96孔板中，培養(yǎng)24h。不同劑量（1×106/ml細(xì)胞分別加入肉毒毒素0μl、1.0μl和2.5μl）A型肉毒毒素（使用時稀釋為50U/ml，蘭州生物制品研究所）干預(yù)1d、2d、3d、4d和5d后，每孔加入10μl CCK-8，培養(yǎng)2.5h。微孔板閱讀器（芬蘭雷勃公司）450nm處讀取吸光度。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡：Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于艾美捷科技有限公司。HKF（2×105個/孔）接種于6孔板中，培養(yǎng)24h。不同劑量A型肉毒毒素干預(yù)72h后，300×g室溫離心5min，收集各孔HKF，冷PBS洗滌兩次。將細(xì)胞重懸在500μl緩沖液中，加入10μl碘化丙啶，反應(yīng)10min;冰浴冷卻終止反應(yīng)。流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測細(xì)胞凋亡情況，CellQuest軟件定量分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 RT-PCR法檢測mRNA相對表達(dá)量：Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-PCR檢測。引物序列來自上海生物工程有限公司。RT-PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 30s;95℃ 5s，60℃ 30s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，-△△CT法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。

1.2.4 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)：HKF接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合100%時，移液槍頭沿板底劃一字型劃痕，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h、48h。顯微鏡下拍攝圖片，Image Pro Plus 6.0軟件分析細(xì)胞遷移情況。細(xì)胞遷移率=（1-測量時劃痕寬度/初始劃痕寬度）×100%。

1.2.5 免疫熒光染色法檢測I型膠原、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和Ki-67：HKF接種于6孔板中，培養(yǎng)24h。A型肉毒毒素干預(yù)72h后，4%多聚甲醛固定，4℃過夜。0.3% Triton X-100室溫處理1h，山羊血清（美國Sigma）37℃阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)30min。HKF與兔抗人抗體4℃孵育過夜，抗體稀釋濃度為I型膠原（1：500）、α-SMA（1：100）和Ki-67（1：1 000）（美國ABCAM）。加入熒光山羊抗兔抗體（美國Sigma）孵育1h，DAPI染色，熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）拍攝圖像。

1.2.6 Western-bolt檢測蛋白表達(dá)水平：取細(xì)胞上清液，加入蛋白裂解液，冰上裂解25min，15 000r/min離心15min。加入SDS緩沖液煮沸5min使蛋白變性。經(jīng)SDS-PAGE后蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1h，孵育一抗，4℃過夜，棄去一抗，TBST洗膜3次，每次5min。室溫孵育二抗2h，棄去二抗，TBST洗膜3次，每次5min。ECL顯色，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白條帶與GAPDH灰度比值。

1.2.7 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力：用無血清培養(yǎng)液將HKF調(diào)整至2×105個/ml，取0.2ml到Transwell小室（上海生工），室下加入10%胎牛血清0.5ml，培養(yǎng)4h。待貼壁后更換上室培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h，拭去小室濾膜上的細(xì)胞，PBS洗滌，甲醛固定15min，HE染色，統(tǒng)計(jì)膜背面侵襲的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲能力=穿膜細(xì)胞穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)/相應(yīng)孔細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用“x?±s”表示，組間比較采用單因素方差分析;重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量資料方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 A型肉毒毒素抑制HKF增殖：CCK-8檢測結(jié)果表明，1.0μl組和2.5μl組均可抑制HKF增殖能力，且2.5μl組較1.0μl組強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1A。免疫熒光染色結(jié)果表明，1.0μl組和2.5μl組Ki-67表達(dá)水平明顯低于0μl組，且2.5μl組較1.0μl組水平更低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1B、D。用1.0μl和2.5μl A型肉毒毒素干預(yù)后，HKF密度明顯降低，且2.5μl組更低（P<0.05），見圖1C。說明A型肉毒毒素可以明顯抑制HKF增殖，且濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。

2.2 A型肉毒毒素促進(jìn)HKF凋亡：流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果，A型肉毒毒素可明顯促進(jìn)HKF凋亡，且藥物濃度越高促進(jìn)凋亡的能力越強(qiáng)（P<0.05）。見圖2。

2.3 A型肉毒毒素減少膠原蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)積累：A型肉毒毒素可以明顯抑制Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白、α-SMA和CTGF基因的表達(dá)，上調(diào)IFN-γ、TGF-β3基因的表達(dá)，且2.5μl的作用比1.0μl強(qiáng)（P<0.05），見圖3A。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，A型肉毒毒素干預(yù)后表達(dá)水平下降，且2.5μl組最為明顯（見圖3B）。Western-blot法檢測結(jié)果表明，2.5μl組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白表達(dá)明顯低于1.0μl組（見圖3C）。

2.4 A型肉毒毒素抑制HKF遷移：A型肉毒毒素可以抑制HKF遷移，且藥物濃度越高，抑制作用越強(qiáng)（P<0.05）。見圖4。

2.5 A型肉毒毒素抑制HKF侵襲：A型肉毒毒素可以明顯抑制HKF侵襲，且藥物濃度越高，抑制作用越強(qiáng)（P<0.05），見圖5A、C。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，A型肉毒毒素可以抑制MMP-1和MMP-3的mRNA表達(dá)水平，且2.5μl組比1.0μl更低（P<0.05），見圖5B。

2.6 A型肉毒毒素對TGF-β/Smad通路和ERK通路的影響：A型肉毒毒素可以抑制TGF-β1、VEGF、PAI-1基因表達(dá)，上調(diào)Smad7，且呈藥物濃度依賴性。Western-blot檢測結(jié)果表明，A型肉毒毒素可以明顯抑制p-Smad2和p-Smad3蛋白表達(dá)水平，并且抑制了p-ERK1/2蛋白表達(dá)，Smad7蛋白表達(dá)上調(diào)，三組Smad 2/3總蛋白和T-ERK 1/2總蛋白的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖6。