魏瑤 劉燕 圖門(mén)白拉 趙明敏

摘要：馬鈴薯病毒病是我國(guó)馬鈴薯作物常見(jiàn)病害之一，是影響馬鈴薯生產(chǎn)的重要因子。內(nèi)蒙古自治區(qū)是我國(guó)最大的馬鈴薯種植區(qū)。目前，內(nèi)蒙古自治區(qū)引起馬鈴薯病毒病的病原種類(lèi)尚不清楚。利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱(chēng)RT-PCR）技術(shù)對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)馬鈴薯主要種植產(chǎn)區(qū)幾種常見(jiàn)的病毒病進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，在27份樣品中有11份樣品為復(fù)合侵染，15份為單獨(dú)侵染。其中，6個(gè)樣品為馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，簡(jiǎn)稱(chēng)PVY）和馬鈴薯卷葉病毒（potato leaf roll virus，簡(jiǎn)稱(chēng)PLRV）的復(fù)合侵染;2份樣品為PVY和馬鈴薯M病毒（potato virus M，簡(jiǎn)稱(chēng)PVM）的復(fù)合侵染;1份樣品為PVY、PLRV和馬鈴薯S病毒（potato virus S，簡(jiǎn)稱(chēng)PVS）的復(fù)合侵染;1份樣品為PVY、PLRV和PVM的復(fù)合侵染;1份樣品為PVY、PLRV、PVM和馬鈴薯A病毒（potato virus A，簡(jiǎn)稱(chēng)PVA）的復(fù)合侵染。15份單獨(dú)侵染的樣品中均檢測(cè)到PVY。27份樣品中均未檢測(cè)到馬鈴薯X病毒（potato virus X，簡(jiǎn)稱(chēng)PVX）。由此可見(jiàn)，無(wú)論復(fù)合侵染還是單獨(dú)侵染均檢測(cè)到PVY。說(shuō)明PVY是引起當(dāng)?shù)伛R鈴薯病毒病的主要病原之一。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯病毒病;反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);植物病毒檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.32?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）08-0111-05

收稿日期：2019-09-24

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31770165）;內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才引進(jìn)科研啟動(dòng)項(xiàng)目（編號(hào)：NDGCC2016-23）。

作者簡(jiǎn)介：魏?瑤（1996—），女，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，主要從事馬鈴薯病毒病的研究。E-mail：weiyao2018@163.com。

通信作者：趙明敏，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物病毒學(xué)的教學(xué)和科研工作。E-mail：mingminzh@163.com。

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）原產(chǎn)于南美洲安第斯山地區(qū)[1]，屬于一年生茄科茄屬作物，是世界第四大糧食作物，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和商品價(jià)值。馬鈴薯病毒病是導(dǎo)致馬鈴薯退化的根本原因，被病毒侵染后一般減產(chǎn)20%～50%，嚴(yán)重的達(dá)80%[2]，病毒病長(zhǎng)期以來(lái)是制約馬鈴薯生產(chǎn)的重要因素。目前，盡管生產(chǎn)上多采用的脫毒種薯能夠在一定程度上減輕病毒病的危害，但生長(zhǎng)中后期田間的病毒再次侵染也可導(dǎo)致產(chǎn)量的大幅度降低。因此，無(wú)論在脫毒種薯生產(chǎn)，還是大田栽培中，馬鈴薯病毒病的檢測(cè)對(duì)保證馬鈴薯穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)至關(guān)重要。目前，已報(bào)道的感染馬鈴薯的病毒多達(dá)35種以上，其中危害嚴(yán)重的有6～7種，包括馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）、馬鈴薯卷葉病毒（potato leaf roll virus，PLRV）、馬鈴薯M病毒（potato virus M，PVM）、馬鈴薯S病毒（potato virus S，PVS）、馬鈴薯A病毒（potato virus A，簡(jiǎn)稱(chēng)PVA）、馬鈴薯X病毒（potato virus X，簡(jiǎn)稱(chēng)PVX）等。隨著病毒檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的馬鈴薯品種均受到一種或幾種病毒的復(fù)合侵染[3]。黃遵錫等對(duì)田間幾種較嚴(yán)重的病毒病害進(jìn)行了免疫電鏡鑒定，分別觀察到PVX、PVY、煙草花葉病毒（TMV）、煙草蝕紋病毒（TEV）病毒粒體及其上的套環(huán)結(jié)構(gòu)[4]。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)從核酸水平檢測(cè)植物病毒，靈敏度高、特異性強(qiáng)，能克服血清學(xué)及其他檢測(cè)方法中的缺點(diǎn)，可以進(jìn)行大批量的樣本檢測(cè)，是目前發(fā)展最快、最有發(fā)展前景的病毒檢測(cè)技術(shù)[5]。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱(chēng)RT-PCR）檢測(cè)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)，在病毒檢測(cè)中越來(lái)越顯示出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)，在馬鈴薯病毒檢測(cè)中應(yīng)用廣泛[6]。

本研究利用RT-PCR技術(shù)對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)馬鈴薯主要種植產(chǎn)區(qū)6種病毒病進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果可為馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)過(guò)程中病毒病的檢測(cè)以及馬鈴薯病毒病的防治提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

2018年在內(nèi)蒙古呼和浩特市、烏蘭察布市等地區(qū)采集疑似馬鈴薯病毒病病株葉片，共27份 （表1），液氮速凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.1.1?主要試劑和儀器

主要試劑有TRIzol RNA提取試劑、DNA Marker、6×DNA loading buffer，均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;隨機(jī)引物、反轉(zhuǎn)錄試劑、PCR mix，均購(gòu)自Promega公司;rTaq酶、10×PCR buffer、2.5 mmol/L dNTP，均購(gòu)自TaKaRa公司。

主要儀器包括Eppendorf移液器、BIO-RAD My Cycler PCR儀、BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)等。

1.1.2?引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道相應(yīng)病毒基因序列設(shè)計(jì)引物（表2），引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?植物總RNA提取

以感染馬鈴薯病毒病植株的葉片和健康葉片為試驗(yàn)材料，稱(chēng)取0.1 g植物組織，采用TRIzol法提取植物總RNA。

1.2.2?RT-PCR檢測(cè)

反轉(zhuǎn)錄體系：以提取的總RNA為模板，用Promega試劑盒，合成第1條鏈，反應(yīng)體系在0.2 mL的PCR管中進(jìn)行，依次加入 0.5 μL Random primers、1 μg RNA，用Nuclease-Free Water補(bǔ)足至5 μL，混勻，在65 ℃ PCR儀中溫育5 min;之后加4 μL 5×Reaction buffer，3.8 μL MgCl2，1 μL PCR Nucleotide Mix，0.5 μL Recombinant RNasin@ Ribonuclease Inhibitor，1 μL Reverse Transcriptase，4.7 μL Nuclease-Free Water;混勻，在PCR儀中25 ℃、5 min，37 ℃、1 h，70 ℃、15 min 合成cDNA，直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增或置于-20 ℃冰箱中保存。

PCR擴(kuò)增程序與凝膠電泳：根據(jù)不同引物調(diào)整退火溫度，主要采用以下PCR擴(kuò)增程序：在25 μL反應(yīng)體系中，加入2 μL cDNA，1 μL引物-F，1 μL引物-R，0.5 μL rTaq酶，2.5 μL 10×PCR buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTP，16 μL dd H2O，反應(yīng)條件為 94 ℃ 預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，Tm（不同引物的退火溫度）退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。取3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，在凝膠成像儀上檢測(cè)并照相。

1.2.3?PCR產(chǎn)物測(cè)序及分析

將擴(kuò)增出PVY特異性條帶的樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

用MEGA 6.0進(jìn)行相關(guān)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，采用相鄰法（neighbor-joining，簡(jiǎn)稱(chēng)NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2?結(jié)果與分析

2.1?馬鈴薯病毒病發(fā)病癥狀

在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)農(nóng)場(chǎng)馬鈴薯田、內(nèi)蒙古呼和浩特市武川縣哈樂(lè)鎮(zhèn)和內(nèi)蒙古烏蘭察布市中加農(nóng)業(yè)生物科技有限公司的試驗(yàn)田進(jìn)行采樣。馬鈴薯植株癥狀表現(xiàn)有花葉、卷葉、矮化、變色等癥狀（圖1）。

2.2?RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

對(duì)27個(gè)樣品進(jìn)行提取總RNA后，獲得cDNA，以cDNA為模板，用引物-F和引物-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果（表3、圖2）顯示，在27份樣品中，11份樣品為復(fù)合侵染，15份為單獨(dú)侵染，而第11號(hào)樣品未檢測(cè)到病毒侵染情況。其中，6份樣品為PVY和PLRV的復(fù)合侵染;2份樣品為PVY和PVM的復(fù)合侵染;1份樣品為PVY、PLRV和PVS的復(fù)合侵染;1份樣品為PVY、PLRV和PVM的復(fù)合侵染;1份樣品為PVY、PLRV、PVM和PVA的復(fù)合侵染。15份單獨(dú)侵染的樣品中均檢測(cè)到PVY。27份樣品中均未檢測(cè)到PVX。由此可見(jiàn)，無(wú)論復(fù)合侵染還是單獨(dú)侵染均檢測(cè)到了PVY。說(shuō)明PVY是引起當(dāng)?shù)伛R鈴薯病毒病的主要病原之一。

2.3?進(jìn)化樹(shù)分析

為進(jìn)一步分析PVY與已報(bào)道的序列的一致性，對(duì)1～18號(hào)中有特異性擴(kuò)增的17個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)序（其中，13號(hào)樣品測(cè)序時(shí)顯示不合格，測(cè)序失?。y(cè)序結(jié)果與GenBank中已登錄的PVY序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，以李痘病毒分離物AnMrPI533（MG 686954）作為外參。結(jié)果（圖3）表明，所擴(kuò)增獲得的PVY片段的序列與GenBank中已登錄的PVY序列相似性很高，其中Y-H-6和Y-H-7樣品在同一分支上，Y-H-3和Y-H-8樣品在同一分支上，他們的親緣關(guān)系最近;Y-H-2樣品與PVY-Jessore（MF589764）親緣關(guān)系較近。

2.4?序列一致性分析

應(yīng)用SDTv.1.0軟件分析PVY測(cè)序序列與GenBank中已登錄的PVY序列核酸一致性（圖4），以李痘病毒分離物AnMrPI533（MG 686954）作為外參。結(jié)果表明，16個(gè)樣品測(cè)序序列與GenBank中已登錄的PVY序列的一致性達(dá)到95%以上。

3?討論

馬鈴薯病毒病是我國(guó)馬鈴薯作物重要病害之一，是制約馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大難題。目前，生產(chǎn)上脫毒種薯的廣泛應(yīng)用雖然能夠在一定程度上解決馬鈴薯種薯退化問(wèn)題，但脫毒種薯質(zhì)量和大田生產(chǎn)中病毒病的再侵染仍是馬鈴薯生產(chǎn)中尚待解決的首要問(wèn)題。為進(jìn)一步明確內(nèi)蒙古自治區(qū)馬鈴薯病毒病的病原是由哪些病毒組成的，本試驗(yàn)利用 RT-PCR技術(shù)在內(nèi)蒙古自治區(qū)馬鈴薯主要種植產(chǎn)區(qū)進(jìn)行了采樣和6種病毒病的檢測(cè)研究。

秦亞南曾在內(nèi)蒙古呼和浩特市周邊6個(gè)旗縣（清水河縣、察右中旗、四子王旗、和林縣、卓資縣、武川縣）進(jìn)行馬鈴薯病毒檢測(cè)，通過(guò)PCR法檢測(cè)了PVX、PVY、PLRV、PVA、PVS、PVM、馬鈴薯帚頂病毒（potato mop-top virus，簡(jiǎn)稱(chēng)PMTV）7個(gè)病毒[7]。結(jié)果表明，6個(gè)地區(qū)的病葉樣品中均能檢測(cè)到PVY，且檢出率較高，為85.6%。PVX、PLRV總檢出率分別為4.8%、26.4%。PVA、PVM、PVS總檢出率分別為12.0%、1.6%、24.8%。PMTV在6個(gè)地區(qū)的樣品中檢出率為0。董代幸在新疆馬鈴薯種薯、商品薯的重要生產(chǎn)基地烏魯木齊檢測(cè)馬鈴薯病毒，結(jié)果表明侵染烏魯木齊地區(qū)馬鈴薯的主要病原病毒有PVX、PVY、PVA、PLRV，類(lèi)病毒為馬鈴薯紡錘塊莖類(lèi)病毒（PSTVd）[8]。其中PVY、PLRV的侵染率最高，其次為PVX、PVA，PSTVd的侵染率較低。顏謙等調(diào)查貴州省不同海拔地區(qū)馬鈴薯病害發(fā)生情況，結(jié)果表明，危害貴州省馬鈴薯較重的病毒種類(lèi)依次為PVS、PVY、PVX、PLRV[9]。

與已有研究結(jié)果相似，本研究發(fā)現(xiàn)在內(nèi)蒙古自治區(qū)的馬鈴薯病毒病主要是PVY與其他幾種病毒如PLRV、PVM、PVS、PVA的混合侵染。在供試樣品中未檢測(cè)到PVX病毒。

很多學(xué)者的報(bào)道中顯示，無(wú)論在脫毒種薯還是大田植株上都很難檢測(cè)到PVS病毒。但本研究在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)農(nóng)場(chǎng)的25號(hào)樣品中檢測(cè)到了PVS病毒。

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