許智強(qiáng)，李敏杰，劉彥玲，周國(guó)輝，于 力

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 牛羊傳染病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱 150069）

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由FMD病毒（FMDV）感染引起的偶蹄動(dòng)物（牛、羊、豬等）的急性、熱性和可快速遠(yuǎn)距離傳播的一類傳染病[1]，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）將其列為A 類烈性傳染病之一。FMDV 現(xiàn)有A、O、C 型（歐洲型）、SAT1、SAT2、SAT3（非洲型）和Asia1 型（亞洲型）等7 個(gè)血清型[2]和眾多的拓?fù)湫?，其中，O型和A 型在我國(guó)流行最為廣泛[3-4]。在現(xiàn)今國(guó)際貿(mào)易日趨繁榮、物資交流和旅游活動(dòng)日益便捷的情況下，許多國(guó)家都有可能再度遭到FMD 的襲擊[5]。大多數(shù)國(guó)家通過(guò)檢測(cè)針對(duì)FMDV 結(jié)構(gòu)蛋白的抗體水平評(píng)價(jià)FMD 疫苗的免疫效力、指導(dǎo)FMD 疫苗的免疫接種計(jì)劃、用于國(guó)際貿(mào)易和血清流行病學(xué)調(diào)查和非免疫地區(qū)的疫情監(jiān)測(cè)，并依此實(shí)行FMD 的免疫清除計(jì)劃。

檢測(cè)FMDV 抗體的經(jīng)典方法為病毒中和試驗(yàn)（VNT），該方法準(zhǔn)確可靠，但需要?jiǎng)佑没畹牟《?，因此只能在專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，且工作量大、耗時(shí)長(zhǎng)，不能進(jìn)行高通量的檢測(cè)。近年來(lái)出現(xiàn)了液相阻斷ELISA 方法（LPBE），該方法使用滅活的病毒作為抗原，避免了散毒的危險(xiǎn)，而且靈敏性高，重復(fù)性更好、檢測(cè)速度更快，尤其適合于大批量血清樣品的檢測(cè)。但LPBE 方法也存在不足之處，在不同動(dòng)物群體可產(chǎn)生不同比率的假陽(yáng)性率，且該方法的穩(wěn)定性還受捕獲多抗和檢測(cè)多抗相關(guān)試劑不同批次的影響。固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA（The solid-phase competition ELISA，SPCE）除了具有LPBE的優(yōu)點(diǎn)外，特異性明顯提升、操作更為簡(jiǎn)便、結(jié)果更穩(wěn)定、重復(fù)性更高[1]，2004 年被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）確立為國(guó)際貿(mào)易中FMD 血清學(xué)檢測(cè)的一種指定方法。

傳統(tǒng)的SPCE 以多克隆抗體作為檢測(cè)試劑的組分，其制備繁瑣、成本高、批次之間變異性大難于標(biāo)準(zhǔn)化，可能存在一定的交叉反應(yīng)。使用單克隆抗體（MAb）可提升檢測(cè)試劑的特異性和批間穩(wěn)定性，且易于標(biāo)準(zhǔn)化、制備成本下降?；谝陨系目紤]，本研究將針對(duì)O 型FMDV 保守表位的MAb 與SPCE 方法相結(jié)合，建立了新型的基于MAb 的SPCE 方法，用于FMDV抗體的定量檢測(cè)。該方法可用于評(píng)價(jià)FMD疫苗的免疫效力，指導(dǎo)FMD疫苗的免疫接種計(jì)劃。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 MAb 3D9[6]（濃度3.47 mg/mL）和8E8[7]（濃度2.97 mg/mL）由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；滅活的O 型FMDV 抗原由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司提供；乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK-21）由本實(shí)驗(yàn)室保存；經(jīng)VNT 檢測(cè)為陰性的血清290 份，包括牛血清140份、豬血清150 份，采自未注射疫苗的未發(fā)生FMD的動(dòng)物；經(jīng)VNT 檢測(cè)為O 型FMDV 抗體陽(yáng)性血清230 份，包括牛血清110 份、豬血清120 份，為FMD 滅活疫苗免疫動(dòng)物血清；未經(jīng)檢測(cè)血清510份，包括羊血清120 份、牛血清160 份、豬血清230份；健康雌性BALB/c小鼠購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；TMB 底物和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）購(gòu)自Sigma 公 司；O 型FMDV 抗 體 液 相 阻 斷ELISA 檢 測(cè) 試劑盒購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所；O 型FMDV ELISA 抗體檢測(cè)診斷Jeno 試劑盒購(gòu)自韓國(guó)金諾生物科技公司；酶標(biāo)板購(gòu)自Costar 公司；DEAE-Sephadex A-50 層析柱購(gòu)自GE 公司；A 型FMDV抗體陽(yáng)性參考血清以及牛冠狀病毒（BCV）、牛輪狀病毒（BRV）以及豬繁殖和呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬瘟病毒（CSFV）的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 HRP 標(biāo)記抗體 按文獻(xiàn)[8]中的碘酸鈉法標(biāo)記純化8E8 抗體。采用本實(shí)驗(yàn)室建立的直接ELISA 方法檢測(cè)HRP 標(biāo)記抗體的抗體效價(jià)。

1.3 SPCE 反應(yīng)條件的優(yōu)化 選取10 份經(jīng)VNT 檢測(cè)為O 型FMDV 抗體陽(yáng)性的血清（包括4 份牛血清和6 份豬血清）和10 份經(jīng)VNT 檢測(cè)為陰性的血清（包括4 份牛血清和6 份豬血清）作為待檢血清。采用MAb 3D9 作為捕獲抗體，以O(shè) 型FMDV 病毒粒子作為抗原，HRP-8E8 作為檢測(cè)MAb，將檢測(cè)MAb 與待檢血清同時(shí)加入ELISA 板中，反應(yīng)后采用TMB 顯色液進(jìn)行顯色。采用方陣方法，優(yōu)化各反應(yīng)條件：MAb 3D9包被濃度（1∶1 000、1∶2 000、1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000）、抗原濃度（1∶1、1∶2、1∶3）、抗原孵育時(shí)間（1 h、2 h）、檢測(cè)MAb 8E8 稀釋度（1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000）、檢測(cè)MAb與待檢血清孵育時(shí)間（1 h、2 h）、顯色液顯色時(shí)間（10 min、15 min、20 min），初步建立檢測(cè)血清中O型FMDV 抗體的SPCE 方法。

1.4 陰性和陽(yáng)性臨界值的判定 利用本研究建立的SPCE 方法檢測(cè)289 份陰性血清和227 份陽(yáng)性血清。以抑制百分率PI 作為結(jié)果判定依據(jù)，參照結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)檢測(cè)血清進(jìn)行定性評(píng)價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1 HRP-8E8 的效價(jià)測(cè)定結(jié)果 通過(guò)直接ELISA方法對(duì)HRP-8E8 進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，在1∶4 000 稀釋時(shí)OD450nm接近1.0，從而確定HRP-8E8的效價(jià)為1∶4 000。

2.2 SPCE 各組分工作濃度的確定 經(jīng)方陣滴定法確定該SPCE 方法的最優(yōu)反應(yīng)條件見表1。

表1 SPCE 最佳工作濃度的確定Table 1 Determination of the optimal working concentration of SPCE

1.5 特異性試驗(yàn) 利用本研究建立的SPCE 分別檢測(cè)A 型FMDV 抗體陽(yáng)性參考血清以及BCV、BRV、PRRSV、PCV 及CSFV 的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，并以1 份經(jīng)VNT 檢測(cè)為O 型FMDV 抗體陽(yáng)性的豬血清作為對(duì)照，檢測(cè)該方法特異性。

1.6 敏感性試驗(yàn) 將1 份經(jīng)VNT 檢測(cè)為O 型FMDV抗體陽(yáng)性的豬血清，以1∶4 為起始稀釋倍數(shù)經(jīng)2 倍倍比稀釋（1∶4～1∶1 024）后，利用本研究建立的SPCE 方法、LPBE 和VNT 分別進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)該方法的敏感性。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 利用同一批次制備的ELISA 板，選取6 份待檢血清在3 個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)，試驗(yàn)重復(fù)3 次，評(píng)價(jià)該方法的批內(nèi)重復(fù)性；利用3 個(gè)批次包被的ELISA 板，選取6 份待檢血清進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)重復(fù)3 次，評(píng)價(jià)該方法的批間重復(fù)性。

1.8 SPCE 與LPBE、VNT 檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性比較從510 份未經(jīng)檢測(cè)血清中隨機(jī)選擇108 份血清，包括羊血清15 份、豬血清51 份、牛血清42 份，分別利用SPCE、LPBE 和VNT 檢測(cè)抗體滴度，比較檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性。

1.9 SPCE 方法的臨床應(yīng)用 采用本研究建立的SPCE 方法和韓國(guó)Jeno 試劑盒分別對(duì)120 份羊血清、160 份牛血清、230 份豬血清進(jìn)行檢測(cè)，比較檢測(cè)結(jié)果。

2.3 SPCE 臨界值的確定 PI 統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，最佳區(qū)分陰陽(yáng)性血清的稀釋度為1∶32，陰陽(yáng)性血清在此稀釋度無(wú)交叉。所有陰性血清的PI 值均小于45%，而所有陽(yáng)性血清的PI 值均高于45%。因此，當(dāng)血清1∶32 稀釋時(shí)，將SPCE 檢測(cè)的PI 臨界值確定為45%（圖1）。

圖1 O 型FMDV 抗體SPCE 檢測(cè)陰性血清和陽(yáng)性血清的百分抑制率（PI 值）分布圖Fig.1 Frequency distribution of the percentage inhibitions recorded from detection of positive and negative sera detected by the type O FMDV antibody SPCE

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果 用O 型FMDV 抗體SPCE 分別檢測(cè)A 型FMDV 抗體陽(yáng)性參考血清及BCV、BRV、PRRSV、PCV、CSFV 的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清。檢測(cè)結(jié)果均為陰性，未出現(xiàn)交叉反應(yīng)（表2）。表明該方法特異性良好。

2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 取1份經(jīng)VNT檢測(cè)為O型FMDV抗體陽(yáng)性的豬血清樣品2 倍倍比稀釋后，經(jīng)本研究建立的SPCE 方法檢測(cè)，評(píng)估該方法的敏感性。結(jié)果顯示，ELISA 檢測(cè)OD450nm值與VNT 測(cè)定的效價(jià)呈正相關(guān)，隨著陽(yáng)性血清稀釋倍數(shù)增加，其OD450nm值平緩遞減。當(dāng)陽(yáng)性血清稀釋至1∶512 時(shí)，檢測(cè)得到的PI 值仍大于45，而稀釋到1∶1 024 時(shí)，PI 值小于45，判為陰性。所以該方法的敏感性為1∶512，表明該方法的敏感性較高。LPBE 的敏感性為1∶1 024，VNT 的敏感性為1∶256（圖2，表3），表明SPCE 的敏感性相比LPBE 與VNT 更為接近。

表2 特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Specificity test results

圖2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Sensitivity experiment of the SPCE(A)and the LPBE(B)

表3 VNT 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Sensitivity experiment of the VNT

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 利用同一批次制備的ELISA板，檢測(cè)隨機(jī)抽取的6 份血清，結(jié)果顯示批內(nèi)變異系數(shù)低于10%；利用不同批次制備的ELISA 板檢測(cè)隨機(jī)抽取的6 份血清，結(jié)果顯示批間變異系數(shù)低于10%（表4）。表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 SPCE 與LPBE、VNT 檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性比較比較SPCE、LPBE 和VNT 的檢測(cè)結(jié)果，其中SPCE 與LPBE 的相關(guān)系數(shù)為0.896（圖3A），與VNT 的相關(guān)系數(shù)為0.923（圖3B），均屬于高度相關(guān)。且該方法與VNT 相關(guān)性更高，表明該方法檢測(cè)結(jié)果具有良好的可靠性。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 4 Reproducibility test results of SPCE(n=6)

圖3 SPCE 與LPBE（A）、VNT（B）檢測(cè)抗體的相關(guān)性及回歸方程Fig.3 Scatter plots and calculated regression lines for LPBE(A),VNT(B)and SPCE

2.8 SPCE 的臨床應(yīng)用 檢測(cè)羊血清120 份，本研究建立的SPCE 方法與Jeno 試劑盒總體符合率為91.4%，其中陽(yáng)性符合率為91%，陰性符合率為84.3%。檢測(cè)牛血清160 份，本研究建立的SPCE 方法與Jeno 試劑盒總體符合率為89%，陽(yáng)性符合率為89.5%，陰性符合率為88%。檢測(cè)豬血清230 份，其中總體符合率為90%，陽(yáng)性符合率為91%，陰性符合率為89%。結(jié)果表明該SPCE 方法檢測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確，可用于O 型FMDV 血清抗體的檢測(cè)。

3 討 論

血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)是FMD 防治的重要技術(shù)，在FMD 暴發(fā)和流行時(shí)結(jié)合其它方法可對(duì)疫情進(jìn)行預(yù)測(cè)和判斷，而且能對(duì)FMD 疫苗的免疫效力進(jìn)行評(píng)估。目前，我國(guó)主要使用LPBE 試劑盒檢測(cè)抗體對(duì)FMD疫苗的免疫效力進(jìn)行評(píng)估。OIE 推薦的3 種檢測(cè)FMDV 抗體的方法為：VNT、LPBE 和SPCE。VNT 是經(jīng)典的抗體檢測(cè)方法，是評(píng)價(jià)其它方法的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究在國(guó)際上采用的多克隆抗體SPCE 方法的基礎(chǔ)上，建立了基于MAb 的SPCE 方法。同使用多克隆抗體血清相比，MAb 用作檢測(cè)試劑有特異性好、批次之間穩(wěn)定、易于標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。

本研究中使用的包被MAb 3D9，具有與7 個(gè)血清型FMDV 結(jié)合的能力和很強(qiáng)的抗原捕獲能力[6]。本研究中使用的檢測(cè)MAb 8E8，能夠與O 型FMDV各基因型的所有病毒株結(jié)合，是O 型廣譜且具有強(qiáng)中和活性的MAb[7]。利用有中和活性的MAb 建立SPCE 方法，可以增強(qiáng)方法的特異性。且檢測(cè)結(jié)果與VNT 的相關(guān)性更高，可以更好地反映出疫苗的免疫效果。該ELISA 方法的術(shù)式中，將檢測(cè)MAb 和待檢血清同時(shí)加入ELISA 板中，只需1 h 反應(yīng)時(shí)間，而LPBE 方法一般需要4.5 h 的反應(yīng)時(shí)間，相比之下本研究構(gòu)建的SPCE 步驟簡(jiǎn)單能節(jié)省許多時(shí)間。

批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的方法精密度較高。這可能與該方法使用了MAb，質(zhì)量穩(wěn)定有關(guān)。且該方法采用SPCE 的術(shù)式，增強(qiáng)了方法的穩(wěn)定性。

本研究對(duì)3 種抗體檢測(cè)方法的相關(guān)性進(jìn)行了比較研究。分別用SPCE、LPBE 和VNT 測(cè)定了108 份血清的抗體滴度，SPCE 與LPBE 的相關(guān)系數(shù)是0.896、與VNT 的相關(guān)系數(shù)是0.923?？梢奡PCE 與VNT 具有高度的相關(guān)性。在檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，有些疫苗免疫血清，用LPBE 可檢測(cè)出較高的抗體滴度，而使用SPCE 和VNT 只能檢測(cè)出較低的抗體滴度。這可能是由于疫苗免疫之后誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了一部分無(wú)中和活性的抗體，而本研究建立的SPCE 和VNT 方法檢出的是中和活性有關(guān)的抗體。這可能也從另一個(gè)方面說(shuō)明了LPBE 特異性較低的原因。

本研究以3D9 作為包被MAb、8E8 作為檢測(cè)MAb，建立了O 型FMDV 抗體SPCE 檢測(cè)方法，并進(jìn)行了臨床應(yīng)用。該方法的特異性和敏感性良好，與VNT 和LPBE 的相關(guān)性和符合率均較高，批內(nèi)和批間差異性小，為國(guó)內(nèi)O 型FMDV 抗體的檢測(cè)建立了一種新的方法。