謝靜靜 張金花 金劍英 金 丹 郭群依

全世界每年約有100 萬名婦女罹患乳腺癌，由于該病而死亡的人數(shù)超過37 萬[1-2]。雌激素可通過雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）與胰島素樣生長因子1 受體（Insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）途徑相互作用，繼而增加增殖，降低對細胞凋亡的敏感性[3-4]。IGF-1R/絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threoninekinase，Akt）可以傳輸來自受體酪氨酸激酶（receptortyrosinekinase，RTK）和G 蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled receptor，GPCRs）的信號，這些信號可被生長因子或細胞因子激活[5-6]。盡管RTK 介導的信號轉(zhuǎn)導途徑重疊，IGF-1R 介導的活化Akt 特別有助于IGF-1R 的抗凋亡活性[7-8]。山茱萸提取物是屬于異黃酮類，包含許多可能抑制癌變的化合物，例如蛋白酶抑制劑、植酸、異黃酮；研究表明，山茱萸提取物的抗癌作用是由某些類型的細胞凋亡介導的，低濃度的山茱萸提取物可通過上調(diào)B 細胞淋巴瘤因子-2（Bcl-2），下調(diào)Bcl-2 相關(guān)的X（Bax）蛋白來促進凋亡，從而對MCF-7 細胞的增殖產(chǎn)生抑制作用[9-10]。本研究擬探討山茱萸提取物對乳腺癌細胞MDA-MB-231 侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用及機制，為乳腺癌的治療提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 材料 人乳腺癌細胞MDA-MB-231（美國典型培養(yǎng)物保藏中心，批號KTL-66792）。

1.2 主要藥品及試劑 山茱萸提取物（陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司，批號190123）；RPMI-1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基（美國Life Technologies 公司，批號SJB-Q017、SKB-Q008）；順鉑（德國默克公司，批號S5485）；胰蛋白酶（武漢博士德生物工程有限公司，批號20181207）；胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）、無血清的Dulbecco's 改良的Eagle 培養(yǎng)基、硝酸纖維素膜（碧云天生物技術(shù)研究所，批號CT0507、CT0108、CT6074、CM5533）；MTT 溶液（美國Sigma-Aldrich 公司，批號MR-781）；二甲基亞砜（美國Origen Bioedical 公司，批號P60178）；transwell 遷移室（德國Greiner 公司，批號DM-0079）；基質(zhì)膠（美國BD 公司，批號P0873K）；TRIzol 試劑（美國Invitrogen公司，批號IK5013）；PrimeScript RT 試劑盒、SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（寶生物工程大連有限公司，批號RR047A、RR0584）；RIPA 緩沖液、蛋白酶、磷酸酶抑制劑、NuPAGE 轉(zhuǎn)移緩沖液（美國Sigma 公司，批號SA5466、SA0977、SA3011、SA7756）；Bio-rad 蛋白質(zhì)測定染料試劑、NuPAGE Bis-Tris 凝膠、MOPS 運行緩沖液、5%脫脂乳TBS-T（賽默飛世爾科技有限公司，批號XY-2024R、XY-3077D、XT-5047、XA-0067）；3%牛血清白蛋白（上海信裕生物科技有限公司，批號190201）；兔抗人IGF-1R 單克隆抗體、兔抗人Akt 單克隆抗體、鼠抗人β-肌動蛋白（德國Millipore 公司，批號MAB5328、MAB1501、MAB4019）；HRP 偶聯(lián)的二抗（美國Cell Signaling 公司，批號CS1123）。

1.3 儀器 ELx800 酶標儀（美國BioTek Instuments 公司）；奧林巴斯AI09 倒置光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Nikon Eclipse TS100 顯微鏡（日本Nikon 公司）；ABI 7500 實時PCR 系統(tǒng)（美國ABI 公司）；Pierce ECL 系統(tǒng)（美國通用公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)及分組 將人乳腺癌細胞MDA-MB-231 分成四組，并在補充有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MDA-MB-231 細胞組:細胞濃度為5×106/mL 的人乳腺癌MDA-MB-231 細胞液在10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為:37℃、5%CO2、2%O2、93%N2；順鉑組:人乳腺癌MDA-MB-231 細胞培養(yǎng)方法同人乳腺癌MDA-MB-231 細胞組，加入順鉑，使順鉑最終為100.0μg/mL（預試驗求出順鉑對乳腺癌細胞MDA-MB-231 的LC50 為200.0μg/mL，以1/2 LC50 為作用劑量）；山茱萸提取物低、高劑量組的人乳腺癌MDA-MB-231 細胞培養(yǎng)方法同前人乳腺癌MDA-MB-231 細胞組，各組分別加入山茱萸提取物，使山茱萸提取物最終為100.0、200.0μg/mL（預試驗求出山茱萸提取物對乳腺癌細胞MDA-MB-231的LC50 為400.0μg/mL，以1/2 LC50 為高劑量水平，2 倍間距依次為低劑量水平）。以上各組每孔設(shè)6 個平行樣，培養(yǎng)72h。

2.2 細胞活力及單克隆數(shù)目測定 為了進行細胞增殖測定，將細胞用0.25%胰蛋白酶消化，以1000 個細胞/孔的密度接種到96 孔板中，最終體積為100μL，并保持在補充有10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，將10μL MTT 溶液加入并將細胞在37°C 下再孵育4h。將藍色的甲基藍晶體溶于100μL 二甲基亞砜中，并使用ELx800 酶標儀在490nm 處測量吸光度（OD 值）。細胞存活率=（實驗組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）。

用不同濃度的山茱萸提取物處理細胞72h 后，將細胞接種在6 孔板（500 個細胞/孔）中，每2～3 天用新鮮培養(yǎng)基更換。兩周后，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）小心洗滌細胞。隨后，將細胞用4%多聚甲醛固定15min（室溫下），然后在結(jié)晶紫中染色20min（室溫下）。通過數(shù)碼相機捕獲菌落的圖像。

2.3 細胞遷移測定 使用刮擦傷口愈合試驗測定，將細胞以每孔2.5×105個細胞的量接種在6 孔板中，并在2 天之內(nèi)生長至匯合以形成單層，并在實驗前1天使血清饑餓。用200μL 移液器鈍頭在每個孔中進行一次刮擦，并將細胞培養(yǎng)基更改為1%FBS。在16h固定，并使用奧林巴斯AI09 倒置光學顯微鏡以×10放大倍數(shù)獲取圖像。

2.4 細胞侵襲測定 使用transwell 遷移室進行細胞侵襲測定，將5×103細胞接種在涂有12.5μg 減少生長因子的基質(zhì)膠的8μm 多孔Transwell 插入片段的上腔中，在無血清的Dulbecco's 改良的Eagle 培養(yǎng)基中孵育。孵育后，將細胞用甲醇固定10min，并用2%結(jié)晶紫染色。用棉簽將未遷移的細胞從transwell 小室中移出。使用倒置的Nikon Eclipse TS100 顯微鏡對染色的Transwell 膜成像。

2.5 細胞IGF-1R、Akt 基因表達測定 按照制造商的規(guī)程，使用TRIzol 試劑從細胞中提取總RNA。使用PrimeScript RT 試劑盒將1μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，按照制造商的操作規(guī)程，將1μL 互補DNA 用于隨后的qPCR 反應(yīng)，所使用的試劑為SYBR Premix Ex Taq，使用的儀器為ABI 7500 實時PCR系統(tǒng)。本試驗所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下:IGF-1R 正向:5'-GGAGTTGTATTTGCCATCACCAGGG-3'，反向:5'-ATGCGCGGGCAAATTTGATCCCATA-3'；Akt 正向:5'-ACAAGCCACAAGATTACAAGAAACGG-3'，反向:5'-CCACCAGAGTGAAAAGAACGATAGCT -3'；GAPDH 正向:5'-TGGAGTCTACTGGCGTCTT-3'，反向:5'-TGTCATATTTCTCGTGGTTCA-3'。PCR 循環(huán)參數(shù)（30個循環(huán)）如下:預變性（95°C，5min），變性（95°C，30s），退火（55°C，30s）和延伸（72°C，60s）。GAPDH 用作內(nèi)部對照。使用2-ΔΔCT 方法計算表達水平，并將其標準化為看家GAPDH 基因的表達水平。

2.6 細胞IGF-1R、Akt 蛋白表達測定 根據(jù)試劑盒說明，用改良的RIPA 緩沖液裂解細胞，并加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑。離心細胞（13000rpm，10min，4℃），Bio-rad 蛋白質(zhì)測定染料試劑測量蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)樣品（10μg）裝入NuPAGE Bis-Tris 凝膠中，并使用MOPS 運行緩沖液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（80～120V，2h）。使用NuPAGE 轉(zhuǎn)移緩沖液將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用3%牛血清白蛋白封閉轉(zhuǎn)移膜1h。所有第一抗體為:兔抗人IGF-1R單克隆抗體、兔抗人Akt 單克隆抗體、鼠抗人β-肌動蛋白，在4℃下與膜孵育過夜。使用5%脫脂乳TBS-T 將HRP 偶聯(lián)的二抗抗體孵育1h。PBS 液洗滌3 次后，根據(jù)制造商的說明使用Pierce ECL 系統(tǒng)進行檢測信號。

2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0 對數(shù)據(jù)進行錄入、統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（） 表示，采用單因素方差分析比較，多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞OD 值、存活率比較 與MDA-MB-231 細胞組比較，順鉑組、山茱萸提取物低、高劑量組MDA-MB-231 細胞OD 值、存活率降低（P＜0.05）；與順鉑組比較，山茱萸提取物低劑量組OD 值、存活率升高（P＜0.05），山茱萸提取物高劑量組OD 值、存活率降低（P＜0.05）；與山茱萸提取物低劑量組比較，山茱萸提取物高劑量組OD值、存活率降低（P＜0.05）。見表1、圖1。

圖1 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞增殖水平比較（結(jié)晶紫染色，×400）

表1 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞OD 值、存活率比較（）

表1 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞OD 值、存活率比較（）

注:順鉑組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 順鉑；山茱萸提取物低劑量組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 山茱萸提取物；山茱萸提取物高劑量組為MDA-MB-231 細胞組+200.0μg/mL 山茱萸提取物；與MDA-MB-231 細胞組比較，aP＜0.05；與順鉑組比較，bP＜0.05；與山茱萸提取物低劑量組比較，cP＜0.05

3.2 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞克隆形成數(shù)目比較 與MDA-MB-231 細胞組比較，順鉑組、山茱萸提取物低、高劑量組克隆形成數(shù)目降低（P＜0.05）；與順鉑組比較，山茱萸提取物低劑量組克隆形成數(shù)目升高（P＜0.05），山茱萸提取物高劑量組克隆形成數(shù)目降低（P＜0.05）；與山茱萸提取物低劑量組比較，山茱萸提取物高劑量組克隆形成數(shù)目降低（P＜0.05）。見表2、圖2。

圖2 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞克隆形成數(shù)目比較（結(jié)晶紫染色，×200）

表2 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞克隆形成數(shù)目比較（個，）

表2 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞克隆形成數(shù)目比較（個，）

注:順鉑組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 順鉑；山茱萸提取物低劑量組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 山茱萸提取物；山茱萸提取物高劑量組為MDA-MB-231 細胞組+200.0μg/mL 山茱萸提取物；與MDA-MB-231 細胞組比較，aP＜0.05；與順鉑組比較，bP＜0.05；與山茱萸提取物低劑量組比較，cP＜0.05

3.3 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞遷移能力比較與MDA-MB-231 細胞組比較，順鉑組、山茱萸提取物低、高劑量組遷移率降低（P＜0.05）；與順鉑組比較，山茱萸提取物低劑量組遷移率升高（P＜0.05），山茱萸提取物高劑量組遷移率降低（P＜0.05）；與山茱萸提取物低劑量組比較，山茱萸提取物高劑量組遷移率降低（P＜0.05）。見表3、圖3。

圖3 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞遷移比較（×10）

3.4 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞侵襲能力比較與MDA-MB-231 細胞組比較，順鉑組、山茱萸提取物低、高劑量組穿膜數(shù)降低（P＜0.05）；與順鉑組比較，山茱萸提取物低劑量組穿膜數(shù)升高（P＜0.05），山茱萸提取物高劑量組穿膜數(shù)降低（P＜0.05）；與山茱萸提取物低劑量組比較，山茱萸提取物高劑量組穿膜數(shù)降低（P＜0.05）。見表4、圖4。

表3 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞遷移能力比較（%，）

表3 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞遷移能力比較（%，）

注:順鉑組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 順鉑；山茱萸提取物低劑量組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 山茱萸提取物；山茱萸提取物高劑量組為MDA-MB-231 細胞組+200.0μg/mL 山茱萸提取物；與MDA-MB-231 細胞組比較，aP＜0.05；與順鉑組比較，bP＜0.05；與山茱萸提取物低劑量組比較，cP＜0.05

圖4 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞穿膜數(shù)數(shù)目比較（結(jié)晶紫染色，×400）

表4 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞侵襲能力比較（個，）

表4 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞侵襲能力比較（個，）

注:順鉑組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 順鉑；山茱萸提取物低劑量組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 山茱萸提取物；山茱萸提取物高劑量組為MDA-MB-231 細胞組+200.0μg/mL 山茱萸提取物；與MDA-MB-231 細胞組比較，aP＜0.05；與順鉑組比較，bP＜0.05；與山茱萸提取物低劑量組比較，cP＜0.05

3.5 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞IGF-1R、Akt mRNA 表達 與MDA-MB-231 細胞組比較，順鉑組、山茱萸提取物低、高劑量組IGF-1R、Akt mRNA表達水平降低（P＜0.05）；與順鉑組比較，山茱萸提取物低劑量組IGF-1R、Akt mRNA 表達水平升高（P＜0.05），山茱萸提取物高劑量組IGF-1R、Akt mRNA表達水平降低（P＜0.05）；與山茱萸提取物低劑量組比較，山茱萸提取物高劑量組IGF-1R、Akt mRNA表達水平降低（P＜0.05）。見表5。

3.6 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞IGF-1R、Akt蛋白表達 與MDA-MB-231 細胞組比較，順鉑組、山茱萸提取物低、高劑量組IGF-1R、Akt 蛋白表達降低（P＜0.05）；與順鉑組比較，山茱萸提取物低劑量組IGF-1R、Akt 蛋白表達升高（P＜0.05），山茱萸提取物高劑量組IGF-1R、Akt 蛋白表達降低（P＜0.05）；與山茱萸提取物低劑量組比較，山茱萸提取物高劑量組IGF-1R、Akt 蛋白表達降低（P＜0.05）。見表6、圖5。

圖5 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞IGF-1R、Akt 蛋白表達的比較

4 討論

山茱萸提取物對多種類型的實體瘤具有顯著的抗癌活性，尤其是對轉(zhuǎn)移性乳腺癌和難治性卵巢癌的抗癌活性[11]。研究表明，高濃度的山茱萸提取物誘導人肝癌細胞G1 和G2/M 期的細胞周期停滯。此外高濃度的乳腺癌細胞會降低細胞周期蛋白D1 的表達[12]。本研究結(jié)果顯示，與MDA-MB-231 細胞組比較，順鉑組、山茱萸提取物低、高劑量組OD 值、存活率、單克隆形成數(shù)目、遷移率、穿膜數(shù)降低；與順鉑組比較，山茱萸提取物低劑量組OD 值、存活率、單克隆形成數(shù)目、遷移率、穿膜數(shù)升高，山茱萸提取物高劑量組OD 值、存活率、單克隆形成數(shù)目、遷移率、穿膜數(shù)降低；與山茱萸提取物低劑量組比較，山茱萸提取物高劑量組OD 值、存活率、單克隆形成數(shù)目、遷移率、穿膜數(shù)降低。這與上述討論一致，同時說明山茱萸提取物對乳腺癌細胞MDA-MB-231 增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移具有明顯抑制作用，200.0μg/mL 的山茱萸提取物效果尤為明顯。

表5 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞IGF-1R、Akt mRNA表達比較（）

表5 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞IGF-1R、Akt mRNA表達比較（）

注:順鉑組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 順鉑；山茱萸提取物低劑量組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 山茱萸提取物；山茱萸提取物高劑量組為MDA-MB-231 細胞組+200.0μg/mL 山茱萸提取物；IGF-1R 為胰島素樣生長因子1 受體；Akt 為絲氨酸/蘇氨酸激酶；與MDA-MB-231 細胞組比較，aP＜0.05；與順鉑組比較，bP＜0.05；與山茱萸提取物低劑量組比較，cP＜0.05

表6 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞IGF-1R、Akt 蛋白表達比較（）

表6 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞IGF-1R、Akt 蛋白表達比較（）

注:順鉑組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 順鉑；山茱萸提取物低劑量組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 山茱萸提取物；山茱萸提取物高劑量組為MDA-MB-231 細胞組+200.0μg/mL 山茱萸提取物；IGF-1R:胰島素樣生長因子1 受體；Akt:絲氨酸/蘇氨酸激酶；與MDA-MB-231 細胞組比較，aP＜0.05；與順鉑組比較，bP＜0.05；與山茱萸提取物低劑量組比較，cP＜0.05

IGF-1R 在各種癌癥的細胞生長、分化和進展中起著關(guān)鍵作用。據(jù)報道，IGF-1R 在許多人類癌癥中都過表達，包括乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌，IGF-1R（IGF-1R 的一種配體）的高循環(huán)水平與多種類型癌癥的風險增加有關(guān)，這主要取決于IGF-1/IGF-1R 下游信號的激活[13-14]。在被IGF-1 激活后，IGF-1R 的酪氨酸激酶活性使下游底物磷酸化，進而導致其下游信號通路的激活，包括磷脂酰肌醇3 激酶/RAC-α 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信號級聯(lián)[15]。人乳腺癌中IGF-1R 的破壞導致IGF-1R 相關(guān)細胞增殖的抑制。配體誘導的IGF-1R 酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化導致許多細胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導分子（包括Akt 信號級聯(lián)反應(yīng)）的活化[16]。Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可通過失活促凋亡蛋白來促進細胞存活。已經(jīng)提出了許多通過激活Akt 信號來抑制細胞死亡的機制。因此，對IGF-1R 信號的干擾被認為是潛在的癌癥治療策略[17]。本次研究結(jié)果顯示，與MDA-MB-231 細胞組比較，順鉑組、山茱萸提取物低、高劑量組IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白表達降低；與順鉑組比較，山茱萸提取物低劑量組IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白表達升高，山茱萸提取物高劑量組IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白表達降低；與山茱萸提取物低劑量組比較，山茱萸提取物高劑量組IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白表達降低。這說明，山茱萸提取物的濃度越高，IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白表達就越低，200.0μg/mL 的山茱萸提取物效果尤為明顯，這提示山茱萸提取物可抑制IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白的表達進而抑制IGF-1R/Akt 信號通路的激活。

綜上所述，山茱萸提取物對乳腺癌細胞MDAMB-231 增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移具有明顯抑制作用，200.0μg/mL 的山茱萸提取物效果尤為明顯；其機制可能與山茱萸提取物抑制IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白的表達進而抑制IGF-1R/Akt 信號通路的激活有關(guān)。