徐俊鴻 鄧卓燕 譚志濱 歐陽燕婷

蘆薈是多年生百合科草本植物，富含多種活性物質(zhì)，素有“萬應良藥”“天然美容師”“家庭醫(yī)生”等美稱[1-4]。2015年版《中華人民共和國藥典》收載的蘆薈，為蘆薈汁的濃縮干燥物，功能清肝熱、通便，用于便秘、小兒疳積、驚風，外治濕癬?，F(xiàn)代藥理研究表明，蘆薈可以調(diào)節(jié)機體免疫[5]、抗病毒、抗菌消炎[6]、促進傷口愈合、減少瘢痕形成等，外用對化療性靜脈炎、動靜脈內(nèi)瘺功能維護、褥瘡及痤瘡等有良好的療效[7-12]?，F(xiàn)生產(chǎn)的蘆薈鮮藥汁臨床主要用于預防和治療放化療后皮炎和靜脈炎，但因其為現(xiàn)榨現(xiàn)用難以保存。本研究以蘆薈鮮藥汁為對象，用不同的物理和化學保鮮方法進行處理，探索出最優(yōu)的保鮮技術(shù)并確定保質(zhì)期，解決蘆薈鮮藥汁生產(chǎn)上的不便，為產(chǎn)品的批量生產(chǎn)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司，UV-3000)；萬分之一天平(常州幸運電子設(shè)備有限公司，F(xiàn)A2004)；黏度計(上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司，NDJ-5S)；攪拌機。甘露糖(上海源聚生物科技有限公司，批號180916)，檸檬酸(廣州化學試劑廠，AR)，抗壞血酸片(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，5180304)，亞硫酸鈉(廣州化學試劑廠，AR)，其它試劑均為分析純。庫拉索蘆薈，采自廣州中醫(yī)藥大學附屬順德醫(yī)院鮮藥種植基地。

1.2 方法

1.2.1 甘露糖標準溶液的制備精密稱取甘露糖0.1 g至100 ml容量瓶，純化水溶解并定容至刻度，搖勻得1.000 mg/ml甘露糖標準儲備液。

1.2.2 苯酚-硫酸法顯色檢測精確吸取甘露糖標準儲備液0.50、1.00、2.00、2.50、5.00 ml，分別置于50 ml容量瓶，加水至刻度，分別取上述溶液及供試品溶液2.00 ml，置10 ml具塞試管中，加5%苯酚溶液1.00 ml，快速加入5.00 ml濃硫酸，靜置20 min[13]，以試劑空白為參比，在波長490 nm下測定吸光度A。

1.2.3 蘆薈鮮藥汁保鮮處理取已成熟新鮮蘆薈葉片，洗凈，去刺，削皮，刮下葉內(nèi)膠體部分打漿混勻，分裝于30 ml塑料瓶，封口備用。①物理保鮮：分別將蘆薈鮮藥汁放置常溫、(4±2) ℃(冷藏組)以及(-18±2) ℃(速凍組)貯存，每隔2 d檢測并記錄其外觀和蘆薈多糖的含量變化。通過對照組與物理保鮮組蘆薈多糖含量進行分析，確定最優(yōu)的保鮮溫度。②化學保鮮：分別加入不同濃度檸檬酸(0.5%、1.0%、1.5%)、不同濃度抗壞血酸(0.5%、1.0%、1.5%)，不同濃度亞硫酸鈉(0.5%、1.0%、1.5%)，置(4±2) ℃環(huán)境下保存，每隔2 d檢測并記錄其外觀和蘆薈多糖的含量變化。通過對照組與化學保鮮組的蘆薈多糖含量進行統(tǒng)計學分析，確定最優(yōu)的防腐劑和保鮮濃度。

1.2.4 樣品蘆薈多糖的提取和測定精密稱取各組經(jīng)處理的蘆薈鮮藥汁10 g，加入4倍體積無水乙醇靜置過夜，過濾棄去上清，濾渣加水100 ml，室溫攪拌提取30 min，過濾得濾渣，濾渣用水洗，合并濾液，定容至250 ml容量瓶，即得蘆薈多糖供試品溶液，每隔2 d檢測并記錄其外觀和蘆薈多糖的含量。

1.2.5 統(tǒng)計學方法采用Graph Prism 7.0對不同時間點和組別的蘆薈鮮藥汁的多糖含量進行Pearson相關(guān)分析、t檢驗以及方差分析，確定最優(yōu)的物理和化學保鮮方法。

1.2.6 長期穩(wěn)定性試驗根據(jù)1.2.4項提取方法和1.2.5項下保鮮條件平行制備3批蘆薈鮮藥汁，冷藏(4 ℃)并添加0.1%檸檬酸進行防腐，保存1個月，期間每隔2 d檢測并記錄其外觀和蘆薈多糖的含量，按照蘆薈多糖含量衰減10%的時間(T90%)確定鮮藥汁的有效期。

2 結(jié)果

2.1 鮮藥外觀性狀變化各組成品均呈黃綠色黏稠液體，具特殊臭味。其中常溫組的蘆薈鮮藥汁在成品后3 d稠度開始變稀，出現(xiàn)腐敗氣味，成品后5 d出現(xiàn)紅褐色沉淀，30 d藥汁呈紅褐色，具酸敗氣味。冷藏組和冷凍組在成品后25 d稠度開始變稀，出現(xiàn)腐敗氣味，30 d藥汁呈紅褐色，可見紅褐色沉淀。其余組別未見顏色、氣味等性狀變化。

2.2 吸收曲線分別取甘露糖標準溶液和蘆薈多糖供試品溶液2.0 ml，采用苯酚-硫酸法顯色，以試劑空白為參比，在350～600 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果表明，甘露糖和蘆薈多糖溶液在415 nm和490 nm波長下各有一吸收峰，兩者吸收曲線形狀相似。見圖1。

2.3 甘露糖標準曲線按1.2.2項下測定甘露糖標準溶液的吸光度A，以甘露糖濃度(mg/ml)為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明，甘露糖標準曲線為A=14.03C+0.005139(r=1.0000)，在濃度為0.01031～0.2062 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見圖2。

圖1 甘露糖和蘆薈多糖吸收曲線(λ=350～600 nm)

圖2 甘露糖標準曲線

2.4 精密度考察取同一份甘露糖標準溶液和供試品(冷藏組)，采用苯酚-硫酸法顯色，以試劑空白為參比，重復測定其吸光度6次并計算RSD。結(jié)果表明，甘露糖標準溶液吸光度A的RSD=0.20%，蘆薈多糖供試品溶液吸光度的RSD=0.13%，可見儀器精密度良好。見表1。

表1 儀器精密度考察結(jié)果(n=6)

2.5 穩(wěn)定性考察取同一份甘露糖標準溶液和供試品(冷藏組)，采用苯酚-硫酸法顯色，以試劑空白為參比，分別在顯色后0、15、30、60、90、120 min測定其吸光度并計算RSD。結(jié)果表明，蘆薈多糖供試品溶液吸光度的RSD=0.75%，可見供試品溶液在顯色后2 h內(nèi)穩(wěn)定。見表2。

表2 供試品穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.6 重復性考察平行取蘆薈多糖供試品(冷藏組)6份，按1.2.4項下制備供試品溶液，以試劑空白為參比，測定吸光度并計算RSD。結(jié)果表明蘆薈多糖供試品(冷藏組)樣品平均含量為1.6055 mg/g，RSD=0.84%，可見苯酚法測定蘆薈多糖的重復性良好。見表3。

2.7 加樣回收考察精密稱取蘆薈鮮藥汁(冷藏組)5 g，平行6份，按重復性平均含量加入100%甘露糖對照品，按1.2.4項下制備供試品溶液，以試劑空白為參比，測定吸光度并計算甘露糖含量和回收率。結(jié)果表明，回收率范圍為95.06%～103.22%，符合規(guī)定。見表4。

表3 重復性考察結(jié)果(n=6)

2.8 樣品測定分別對物理保鮮組和化學保鮮組的蘆薈鮮藥汁中蘆薈多糖含量進行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果顯示各組的蘆薈多糖含量與時間呈顯著性負相關(guān)(|r|>0.95，α=0.05)。

2.8.1 物理組蘆薈多糖含量變化與常溫組蘆薈鮮藥汁相比，冷藏組和冷凍組顯著性抑制蘆薈多糖的降解(P<0.001)。冷藏組和冷凍組相比，在30 d內(nèi)樣品的蘆薈多糖含量無顯著性差異(P>0.05)。見圖3。

圖3 物理保鮮方法的比較(***，P<0.001)

2.8.2 化學保鮮各組蘆薈多糖含量變化檸檬酸組：與對照組(4±2) ℃相比，0.5%、1.0%和1.5%檸檬酸組的蘆薈多糖含量變化均具有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與0.5%檸檬酸組相比，1.0%和1.5%檸檬酸組的蘆薈多糖含量變化具有顯著性差異(P<0.001)。與1.0%檸檬酸組相比，1.5%檸檬酸組的蘆薈多糖含量變化無顯著性差異(P>0.05)?？箟难峤M：與對照組(4±2) ℃相比，0.5%、1.0%和1.5%抗壞血酸組的蘆薈多糖含量變化均具有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與0.5%抗壞血酸組相比，1.0%和1.5%抗壞血酸組的蘆薈多糖含量變化具有顯著性差異(P<0.001)。1.5%抗壞血酸組的蘆薈多糖含量與1.0%抗壞血酸組相比無顯著性差異(P>0.05)。亞硫酸鈉組：與對照組(4±2) ℃相比，0.5%、1.0%和1.5%亞硫酸鈉組的蘆薈多糖含量變化均具有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與0.5%亞硫酸鈉組相比，1.0%和1.5%亞硫酸鈉組的蘆薈多糖含量變化具有顯著性差異(P<0.001)。1.5%亞硫酸鈉與1.0%亞硫酸鈉相比，可顯著抑制蘆薈多糖含量變化(P<0.001)。各組最優(yōu)保鮮濃度的比較：結(jié)合蘆薈多糖含量變化和成本節(jié)約，從檸檬酸、抗壞血酸和亞硫酸鈉各組篩選最優(yōu)濃度(檸檬酸組1.0%，抗壞血酸1.0%，亞硫酸鈉1.5%)，兩兩比較進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果表明，與1.0%抗壞血酸，1.5%亞硫酸鈉相比，1.0%檸檬酸顯著性抑制蘆薈多糖的降解(P<0.001)。見圖4～5。

圖4 各化學保鮮組蘆薈多糖變化趨勢圖(***，P<0.001)

圖5 各組最優(yōu)化學保鮮濃度的比較分析(***，P<0.001)

2.8.3 長期穩(wěn)定性試驗結(jié)果取本品190304、190308和190315三個批號的樣品，在(4±2) ℃、相對濕度為(60±10)%的條件下放置30 d，每隔2 d取樣考察外觀性狀和蘆薈多糖含量。測定結(jié)果顯示，蘆薈鮮藥汁在30 d保存期內(nèi)均呈黃綠色黏稠液體，具特殊臭味，未見變色腐敗等現(xiàn)象，蘆薈多糖含量變化見表5。

3 討論

本實驗利用苯酚-硫酸法測定蘆薈鮮藥汁的多糖含量，以往研究的蘆薈多糖測定主要以葡萄糖為標準[14, 15]，同時有研究指出甘露糖是蘆薈多糖的主要成分[16]，本研究以甘露糖為標準考察本院制劑蘆薈鮮藥汁的最優(yōu)保鮮技術(shù)。方法學驗證結(jié)果顯示該方法重現(xiàn)性良好(RSD=0.84%)，回收率范圍符合規(guī)定，可準確地測定制劑中蘆薈多糖的含量。

表5 樣品長期穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n=2)

通過比較蘆薈鮮藥汁在常溫、冷藏(T=4 ℃)和冷凍(T=-18 ℃)條件下的蘆薈多糖含量變化，結(jié)果表明低溫環(huán)境可顯著抑制蘆薈鮮藥汁的多糖含量降解(P<0.001)，故降低保存溫度可有效保留鮮藥汁的有效成分。對比冷藏組和冷凍組，二者在30 d內(nèi)蘆薈多糖含量變化趨勢一致，無顯著性差異(P>0.05)，從節(jié)省能源的角度考慮，故物理保鮮方法選擇冷藏(T=4 ℃)保存。

本實驗采用檸檬酸、抗壞血酸和亞硫酸鈉等防腐劑考察蘆薈鮮藥汁的化學保鮮方法，結(jié)果表明30 d內(nèi)鮮藥汁加入檸檬酸、抗壞血酸和亞硫酸鈉均能一定程度抑制蘆薈多糖的降解。其中檸檬酸組和抗壞血酸組的最優(yōu)保鮮濃度均為1.0%和1.5%，為節(jié)約保鮮的成本，擬選取1.0%為檸檬酸和抗壞血酸的最佳濃度，亞硫酸鈉組的最優(yōu)保鮮濃度為1.5%。通過比較各組保鮮劑的最優(yōu)保鮮濃度，發(fā)現(xiàn)相比抗壞血酸和亞硫酸鈉，檸檬酸可明顯減緩蘆薈鮮藥汁中蘆薈多糖含量降解(P<0.001)，故化學保鮮方法可選擇添加保鮮劑檸檬酸(添加濃度為1.0%最佳)保存。

由于蘆薈鮮藥汁呈流質(zhì)狀，水分高，常溫或高溫下容易出現(xiàn)酸敗等變質(zhì)現(xiàn)象，故本研究僅針對低溫保存(4±2) ℃進行穩(wěn)定性考察。長期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)表明，樣品在(4±2) ℃、相對濕度為(60%±10%)的條件下放置30 d，各批樣品的蘆薈多糖含量均出現(xiàn)明顯下降，下降幅度達35%以上，存放時間達14 d后，蘆薈多糖含量降至90%以下，根據(jù)《中華人民共和國藥典》2015版與《原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗指導原則》規(guī)定[17]，本院制劑蘆薈鮮藥汁有效期暫定為14 d。

根據(jù)物理保鮮和化學保鮮結(jié)果，蘆薈鮮藥汁成品后可采用冷藏(4 ℃)和添加1.0%檸檬酸加以保存，該方法可有效預防鮮藥腐敗變色，并抑制產(chǎn)品中蘆薈多糖的分解，有利于產(chǎn)品穩(wěn)定貯存，保證制劑蘆薈鮮藥汁的合理療效和安全使用。