葛 健, 朱彩紅, 吳彥霖, 吳永杰

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院眼科, 上海200025;2.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院, 上海市高血壓研究所,上海市高血壓重點實驗室, 上海200025)

糖尿病患者角膜知覺減退，可能是糖尿病患者的感覺神經病變引起的; 糖尿病患者角膜的愈合能力下降，角膜上皮易出現(xiàn)點狀上皮的缺損; 同時基礎淚液的分泌量減少，更易出現(xiàn)結膜和角膜表面的干燥; 從而使眼表微環(huán)境發(fā)生變化，損害眼表組織[1-2]。本實驗應用人工誘導的糖尿病兔模型來檢測其結膜的基質金屬蛋白酶(MMPs)和基質金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)的表達，結合結膜的病理檢查探討糖尿病兔眼表微環(huán)境改變的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

普通級雄性日本大耳白兔20只, 8周齡, 體質量2.66 ～3.44 kg, 由上海斯萊克實驗動物有限公司提供[SCXK滬2017-0005] 。20只兔隨機分成2組,每組10只。對照組全程給予兔專用配合普通飼料喂養(yǎng); 實驗組給予高脂高糖飼料(普通基礎飼料53%，豬油10%，蔗糖37%)喂養(yǎng)8 周后，以2%鏈脲佐菌素制備糖尿病模型。兔飼養(yǎng)于上海交通大學醫(yī)學院實驗動物科學部[SYXK滬2018-0027]。

1.2 主要試劑和儀器

MMPs 和TIMPs 的ELISA試劑盒購自上海明睿生物有限公司。成纖維細胞生長添加劑(FGS)購自北京裕恒豐生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶溶液均購自上海博谷生物科技有限公司。多克隆抗兔一抗試劑盒購自北京博奧申生物工程有限公司。多克隆抗兔二抗二步法檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中山生物技術有限公司。ELX808 酶標儀購自美國Bio-Tec 公司；Moti-cam3000 顯微攝影成像系統(tǒng)購自美國Motic 公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司。

1.3 糖尿病模型的制備[3]

高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周的實驗組兔10只，進行口服糖耐量試驗及胰島素釋放試驗，對出現(xiàn)胰島素抵抗的兔禁食12 h。以3%戊巴比妥鈉按30 mL/kg 體質量麻醉后，經耳緣靜脈注射現(xiàn)配2%鏈脲佐菌素溶液(65 mL/kg 體質量)，72 h 后再次注射同等劑量鏈脲佐菌素溶液。每2 周測1 次空腹血糖，連續(xù)2 次血糖高于11.0 mmol/L 視為造模成功。本研究中糖尿病實驗組最終造模成功9 只。造模成功后的糖尿病實驗組兔與正常對照組一樣喂以專用配合普通飼料。

1.4 組織取材及處理

實驗組造模成功后2周，2組兔以3%戊巴比妥鈉(30 mL/kg 體質量)麻醉后，逐一將每只兔的雙眼經消毒鋪巾后，每一眼球取結膜2 mm×3 mm 組織，縫合結膜傷口。同時將左眼球結膜剪成2 片1 mm×3 mm 大小，置于4 ℃冰箱保存；右眼球結膜組織置于體積分數(shù)10%中性甲醛溶液中備用。結膜組織解剖上可分為球結膜和瞼結膜，球結膜便于手術取材，本實驗所取結膜均為兔球結膜組織。

1.5 球結膜組織的病理檢查

將2組兔右球結膜組織19份在體積分數(shù)10%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，HE 染色后，在光學顯微鏡下觀察記錄。

1.6 免疫組織化學法測定球結膜的MMP-1、MMP-3 和MMP-9

將2 組19 份兔左球結膜組織經切片常規(guī)脫蠟，在3%H2O2中孵育10 min，用PBS 沖洗2 min共3 次; 將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6)，微波爐中加熱5 min 共2 次，間隔10 min，冷卻至室溫；滴加一抗，4 ℃冰箱放置10 h，PBS沖洗2 min共3 次,再滴加二抗，37 ℃孵育30 min，沖洗2 min 共3 次；DBA 顯色5～10 min，蒸餾水充分沖洗，再用蘇木精復染1 min，常規(guī)脫水至透明，中性膠封片。最后用Motic3000 顯微攝影系統(tǒng)在400 倍下攝片，采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對陽性表達進行定量分析，以積分吸光度代表蛋白相對的表達量，記錄列表。,

1.7 ELISA法檢測球結膜組織細胞培養(yǎng)上清液中TIMP-1 和TIMP-3[4-5]

將2組19份左眼球結膜組織經清洗干凈，修剪組織小于1 mm2后，放入6 孔板中，在CO2培養(yǎng)箱中待干，以后將板翻轉后浸入4 mL 含青霉素-鏈霉素，10%胎牛血清和0.1%FGS的DMEM培養(yǎng)液中。每2 日換培養(yǎng)液1 次；同時用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，用免疫熒光法對成纖維細胞的特異性蛋白進行檢測，以此鑒別成纖維細胞。然后選取4～6 代呈對數(shù)生長期的細胞，把生長至90%的細胞消化后，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成細胞懸液；再以3×105個/mL 細胞密度接種在24 孔板上，每孔注液1 mL。培養(yǎng)24 h 后，更換無血清的DMEM 培養(yǎng)液，每孔1 mL，置于含5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后收集各孔的培養(yǎng)液，經高速離心機以800 r/min 離心25 min；取上清液放入無菌EP管中，分裝置-20 ℃冷凍保存。最后用試劑ELISA 盒，在酶標儀的450 nm波長檢測各孔的吸光度(A)值; 利用標準品的A 值和其相對應的質量濃度，以A 值為橫坐標，質量濃度為縱坐標，把樣本的A 值代入計算得相應的樣本質量濃度(ng/mL)，記錄列表。

1.8 實驗數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS 23.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析處理，計量資料以表示；組間比較采用配對t 檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 組織學觀察

糖尿病實驗組中可見眼結膜上皮排列整齊，上皮下組織明顯減少，結膜組織疏松，可見萎縮的筋膜組織，結膜固有層細胞松散，且細胞間炎性細胞增多，甚至出現(xiàn)多量的炎性細胞局灶狀聚集，少見有彈力纖維 (圖A)。正常對照組可見結膜上皮層排列整齊，上皮層下組織致密且組織層次清晰，結膜組織細胞間炎性細胞少見(圖B)。

圖1 兔球結膜組織學觀察

2.2 MMPs表達

對照組10 只兔球結膜的MMP-1、MMP-3 和MMP-9 表達值分別為(465.32± 76.78) ng/mL、(687.15±82.34) ng/mL 和(697.45±89.56) ng/mL;實驗組9 只兔球結膜MMP-1、MMP-3 和MMP-9 表達值分別為(1 565.48± 98.78) ng/mL、(1 789.45±90.26) ng/mL 和(1 679.35± 103.12) ng/mL，實驗組兔球結膜的MMPs 表達明顯高于對照組(P<0.05)。

2.3 TIMPs 表達

對照組10只兔球結膜TIMP-1 和TIMP-3含量分別為(0.53±0.01) ng/mL 和(0.23 ± 0.01) ng/mL;實驗組9 只兔球結膜細胞TIMP-1 和TIMP-3 含量分別為(0.65±0.01) ng/mL 和(0.13 ± 0.01) ng/mL。

TIMP-1 的表達略高于對照組，但組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。TIMP-3 的表達實驗組明顯低于對照組(P<0.05)。

3 討論

糖尿病以高血糖為最主要臨床表現(xiàn)，高血糖可以使組織細胞分泌的細胞因子發(fā)生改變，從而改變細胞代謝, 使細胞的原有功能發(fā)生改變[6-8]。高血糖可以使眼表的角膜知覺度降低，眼表的淚湖高度減低。本實驗主要觀察了高血糖和球結膜MMPs 和TIMPs 表達間的關系，進一步從球結膜病理上說明了球結膜MMPs 和 TIMPs的表達和糖尿病實驗組兔結膜的損害之間的聯(lián)系。

MMP-1 主要水解纖維類的膠原，MMP-3 能溶解蛋白多糖、纖連蛋白、彈性蛋白等多種膠原蛋白。高血糖也能促進結膜MMP-3 和MMP-9 的高表達[9-10]。MMP-9 有明膠酶活性，可水解變性的膠原和Ⅳ、Ⅴ型膠原蛋白[11]。

糖尿病實驗組的兔球結膜MMP-1、MMP-3和MMP-9 都高于對照組，說明這些膠原酶釋放出成纖維細胞較多，使原細胞內儲存減少。球結膜TIMP-1 和TIMP-2 具有抑制MMP-1、MMP-3和 MMP-9 的活性作用，正常結膜組織的彈性和組織形態(tài)的維護需要MMP-1/TIMP-1 平衡處于正常狀態(tài)。但糖尿病實驗組球結膜TIMP-1的表達與正常對照組的表達差異無統(tǒng)計學意義，說明MMP-1/TIMP-1 的平衡被破壞。另外，糖尿病實驗組兔球結膜TIMP-3 的表達明顯低于正常對照組，說明釋放到成纖維細胞外的膠原酶減少了，MMP-3/TIMP-3 的平衡也被破壞[12]。這些MMPs/TIMPs 失衡過程使球結膜下組織，眼筋膜組織產生過度的降解，造成結膜組織的損害，從而臨床上出現(xiàn)結膜松弛[13]; 結膜松弛可造成淚液膜的不穩(wěn)定，也造成了淚湖的實際容積量減少，從而使角膜結膜組織表面出現(xiàn)干糙，結膜上皮出現(xiàn)易損現(xiàn)象。結膜角膜組織的干燥、淚液膜的不穩(wěn)定和結膜松弛都會進一步促進結膜和角膜的炎癥發(fā)生。本實驗中實驗組兔結膜在光鏡下可以觀察到結膜上皮下組織明顯減少、結膜組織疏松、筋膜組織萎縮、結膜固有層細胞松散，且細胞間炎性細胞增多。

本實驗中實驗組兔結膜實驗取材時并沒有出現(xiàn)結膜炎癥的表現(xiàn)，但是病理上證實有不同程度的炎性細胞浸潤，這與Ward 等[14]的發(fā)現(xiàn)有異，然而作者認為早期的炎性細胞浸潤程度可能和MMP-9 的表達程度有關，也可認為是早期的炎性細胞變化促進了MMPs 的表達，從而更促進了后期球結膜下組織和眼筋膜組織的降解過程。高血糖促進了兔結膜MMPs 的表達，促進實驗兔的結膜和眼筋膜出現(xiàn)彈力纖維的減少，結膜上皮下組織疏松，結膜松弛；從而改變了糖尿病兔的眼表微環(huán)境，出現(xiàn)結膜角膜的干糙和角膜結膜組織的損害。