張 飛, 黨 源, 薛來恩, 溫福利, 鄭和平, 胡德慶

[1.蚌埠醫(yī)學(xué)院?？偨虒W(xué)醫(yī)院(聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院), 福州 350025;2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科, 福州 350004]

關(guān)節(jié)軟骨為高度組織化結(jié)構(gòu)，缺乏未分化細(xì)胞和營養(yǎng)支持，且軟骨細(xì)胞受致密膠原-蛋白多糖基質(zhì)的影響，無法有效增殖和遷移。故關(guān)節(jié)軟骨一旦損傷很難自身修復(fù)。臨床上修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的方法都存在相應(yīng)局限性，如微骨折術(shù)后產(chǎn)生纖維軟骨；自體軟骨移植術(shù)對供區(qū)造成二次損害，以及軟骨細(xì)胞去分化；異體軟骨移植術(shù)存在疾病傳播和免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)等。

組織工程軟骨化是目前修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷最具潛力的方法，其三大基本要素為種子細(xì)胞、支架、細(xì)胞因子。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)來源于中胚層，可分化為同一胚層的組織，包括骨、軟骨、肌肉、神經(jīng)等。BMSCs 易獲取，增殖更新快，是軟骨組織工程中應(yīng)用最廣泛的種子細(xì)胞。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員，是目前發(fā)現(xiàn)的能單獨(dú)誘導(dǎo)骨形成的蛋白質(zhì)分子。研究證實(shí)，BMP-4在體內(nèi)外均能促進(jìn)BMSCs軟骨特異性基質(zhì)Ⅱ型膠原、蛋白多糖的合成，加強(qiáng)成軟骨能力，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)[1]。然而BMSCs 在骨髓中含量極低，BMP 在體內(nèi)很容易被擴(kuò)散稀釋或降解。

本研究通過全骨髓貼壁法體外提取、擴(kuò)增培養(yǎng)兔BMSCs，并通過腺病毒(Ad)載體將BMP-4感染至BMSCs，研究過表達(dá)BMP-4 對BMSCs 增殖和軟骨分化的作用，為軟骨組織工程治療軟骨損傷提供實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 1月齡普通級雄性新西蘭兔4只,體質(zhì)量(700±50) g，由福建省連江玉華山自然生態(tài)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)場[SCXK(閩)2014-0001]提供，飼養(yǎng)于解放軍福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科普通環(huán)境[SYXK(軍)2013-0004]。

1.1.2 藥品試劑 L-DMEM、PBS均購自HyClone公司；0.25%胰蛋白酶(含EDTA)購自Genview 公司；鼠抗兔CD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC、IgG-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC 均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；腺病毒(Ad)介導(dǎo)BMP-4(Ad-BMP-4)載體購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；兔細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原(COLL Ⅱ)、性別決定基因盒9(Sox9)、BMP-4 ELISA 免疫試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司；BMSCs成骨、脂肪、軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液均購自美國Cyagen公司；山羊抗兔GAPDH、Sox9、COLL Ⅱ、BMP-4 多克隆抗體，以及HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 均購自北京鼎國生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs分離和培養(yǎng) 用體積分?jǐn)?shù)3%的戊巴比妥(30 mg/kg)過量麻醉處死新西蘭兔，膝關(guān)節(jié)脫毛，溫水洗凈，仰臥位固定。雙下肢膝關(guān)節(jié)髕骨旁做橫切口，逐層剝離股骨、脛骨，去除表面肌肉、筋膜后置于75%乙醇溶液中，立即移至超凈工作臺中。去除上下干骺端，暴露骨髓腔，10 mL 注射器抽取含體積分?jǐn)?shù)為10% 胎牛血清(FBS)的L-DMEM完全培養(yǎng)液(含青霉素和鏈霉素各100 U/mL)，沖刷骨髓腔，至骨髓腔通透為止。骨髓液經(jīng)200 目篩網(wǎng)過濾2 遍，水平離心機(jī)上以800×g 離心5 min。棄去上清液，用5 mL 10% FBS 完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按1×109/mL的密度接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，記為原代(P0 代)細(xì)胞。8 h 后全定量換液，去除未貼壁的紅細(xì)胞，以后每3 d 全定量換液1 次。待細(xì)胞鋪滿瓶壁85%～90%時，用0.25%含EDTA 胰蛋白酶消化，按1∶2 至1∶3 比例傳代培養(yǎng)，留取P2 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)及表面分子標(biāo)志物鑒定 每日在倒置顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞生長、形態(tài)變化和族群分布狀況。取生長狀態(tài)良好的P2 代細(xì)胞，用0.25%含EDTA的胰蛋白酶1 mL消化，PBS洗滌細(xì)胞1 次。每1×106細(xì)胞用2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 4%的多聚甲醛溶液固定10 min，PBS 洗滌細(xì)胞1 次，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL。取3 個1.5 mL 離心管，每管移入細(xì)胞液100 μL，依次加入1 μL 單克隆抗體CD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC，同時設(shè)立各抗體同型對照IgG-FITC 組，以消除非特異性結(jié)合對結(jié)果的影響。4 ℃避光孵育30 min，PBS 洗滌1 次，1 mL PBS 重懸細(xì)胞，200 目篩網(wǎng)過濾1 次，振蕩混勻后上機(jī)檢測。

1.2.3 成骨、脂肪、軟骨誘導(dǎo)分化 超凈工作臺內(nèi)依次配制好成骨、脂肪、軟骨誘導(dǎo)分化液，取生長狀態(tài)良好的P2 代細(xì)胞，用0.25% 含EDTA的胰蛋白酶1 mL 消化，行錐蟲藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)，確保細(xì)胞密度在1×106/mL，鋪于6 孔板內(nèi)，每2～3 d 更換1 次誘導(dǎo)分化液。21～28 d 后，視細(xì)胞生長狀態(tài)，用2 mL 4%預(yù)冷多聚甲醛溶液固定15 min，分別行茜素紅、油紅O 及阿爾新藍(lán)染色。顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.2.4 Ad-BMP-4 載體構(gòu)建 從含有BMP-4 基因的質(zhì)粒克隆模板中，利用PCR 方法擴(kuò)增目的基因。將載體進(jìn)行酶切，純化的PCR 產(chǎn)物與線性化的載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，對長出的克隆先進(jìn)行酶切鑒定，證明目的基因已經(jīng)定向連入目的載體，再對陽性克隆進(jìn)行測序和分析比對。將構(gòu)建好的Ad 過表達(dá)質(zhì)粒載體進(jìn)行超純?nèi)?nèi)毒素抽提。

1.2.5 Ad-BMP-4 感染BMSCs 梯度及效率分析取P2 代細(xì)胞，消化后鋪于6 孔板中，待細(xì)胞鋪滿瓶壁約80%，消化1 孔細(xì)胞，500 μL 完全培養(yǎng)液重懸，吸取50 μL 細(xì)胞懸液與150 μL 錐蟲藍(lán)染液，充分混合，行細(xì)胞計(jì)數(shù)。取5 個1.5 mL離心管，設(shè)立感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為0、25、50、100、200 的病毒梯度組，根據(jù)MOI=(病毒滴度×病毒體積量)/細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算出對應(yīng)病毒體積量，加入1 mL 含2% FBS、無雙抗的維持液，于對應(yīng)組中換液，錫箔紙包裹后放入5% CO2、37℃培養(yǎng)箱。48 h 后至熒光顯微鏡下觀察綠色熒光并拍照。用500 μL 0.25%胰蛋白酶(含EDTA)消化感染后細(xì)胞，PBS 洗滌1 次，1 mL PBS 重懸，200 目篩網(wǎng)過濾1 次，充分振蕩混勻行流式細(xì)胞術(shù)，檢測綠色熒光蛋白表達(dá)量以確定梯度感染效率及最佳MOI。

1.2.6 感染后的細(xì)胞蛋白收集 取P2 代細(xì)胞，消化，計(jì)數(shù)，鋪于6 孔板內(nèi)。設(shè)立空白對照組、空載病毒組、實(shí)驗(yàn)組，同時每組分別設(shè)立0 d、1 d、3 d、5 d 和7 d 共5 個時間梯度。相應(yīng)時間點(diǎn)消化細(xì)胞，離心，棄上清液，加入預(yù)先配制好的蛋白裂解液(99 μL RIPA+1 μL PMSF)，充分吹勻，-20 ℃冷藏備用。

1.2.7 ELISA 測定感染后相關(guān)蛋白表達(dá)量 將提取的蛋白液解凍，于4 ℃、10 000×g 高速離心5 min，將離心后的蛋白液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中。按照試劑盒說明進(jìn)行成軟骨相關(guān)蛋白COLL Ⅱ、Sox9、BMP-4 的測定。

1.2.8 Western blotting 測定感染后相關(guān)蛋白表達(dá)量 將實(shí)驗(yàn)組0 d、1 d、3 d、5 d 和7 d 的蛋白液解凍，于4 ℃、10 000×g 高速離心2 min，收集上清液，-80 ℃分裝保存。配制濃縮膠及分離膠，每孔加等量蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE 將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，加入脫脂奶粉溶液并置于搖床上封閉1h，分別加入山羊抗兔GAPDH、Sox9、COLL Ⅱ、BMP-4 多克隆抗體(稀釋比例分別為1 ∶2 0 0 0、1 ∶1 0 0 0、1∶1 000、1∶1 000)，于4 ℃冰箱過夜，1×TBS/T 洗滌3 次，再與HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(稀釋比例為1∶3 000)室溫反應(yīng)1 h，1×TBS/T 洗滌3 次，封膜后進(jìn)行曝光。采用Image J 軟件對曝光結(jié)果進(jìn)行定量分析，結(jié)果以目的蛋白與GAPDH 的累積吸光度比值表示。

1.2.9 感染細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 以確定的最佳MOI感染細(xì)胞，并設(shè)立空白對照組、空載病毒組。消化P2 代細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞，確定細(xì)胞密度。配制細(xì)胞懸液，每100 μL 細(xì)胞懸液中包含3 000 個細(xì)胞。在96 孔板中每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，同時每組設(shè)立5 個重復(fù)孔。鋪板后0 d、1 d、3 d、5 d 和7 d，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，振蕩15 s，置于5%、37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h。酶標(biāo)儀490 nm 波長處讀取吸光度(A)值并取平均值，繪制各組細(xì)胞生長曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 鑒定

2.1.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定 72 h 換液，大部分細(xì)胞已貼壁，呈短梭形(圖1A)。前期BMSCs 生長緩慢，10～12 d 可長滿瓶壁90%，呈簇狀或漩渦狀生長，細(xì)胞為短細(xì)梭形(圖1B)。傳代培養(yǎng)至第2 代，5～6 d 細(xì)胞融合可達(dá)瓶壁90%，呈典型漩渦狀分布，細(xì)胞呈長梭形，形態(tài)均一，未見明顯接觸抑制(圖1C)，符合BMSCs 的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。

圖1 新西蘭兔BMSCs 形態(tài)學(xué)觀察 (×100)Figure 1 Morphology of the cultured BMSCs from New Zealand rabbits (× 100)

圖2 新西蘭兔BMSCs 表面分子標(biāo)志物Figure 2 Surface molecular markers of BMSCs from New Zealand rabbits

2.1.2 細(xì)胞表面分子標(biāo)志物鑒定 流式細(xì)胞術(shù)測定, 所獲細(xì)胞低表達(dá)CD34(1.94%)和CD45(2.13%)，高表達(dá)CD44(98.2%)、CD29(99.7%)和CD90(98.8%)(圖2)，可見通過全骨髓貼壁法培養(yǎng)可獲得較高純度的BMSCs。

2.1.3 成骨、脂肪、軟骨誘導(dǎo)分化 對P2代細(xì)胞成功進(jìn)行三系誘導(dǎo)分化，即成骨、成脂肪、成軟骨誘導(dǎo)分化。經(jīng)茜素紅染色，成骨誘導(dǎo)分化組中可見大量紅色鈣鹽結(jié)節(jié)的形成(圖3A)。經(jīng)油紅O 染色，成脂肪誘導(dǎo)分化組中可見細(xì)胞變大、變圓，同時伴有大量橘紅色脂肪空泡的形成(圖3B)。經(jīng)阿爾新藍(lán)染色，成軟骨誘導(dǎo)組中可見大量藍(lán)色顆粒形成(圖3C)。

2.2 Ad-BMP-4 感染BMSCs 梯度及效率分析

熒光顯微鏡下，隨著MOI 梯度(0、25、50、100、200)的增加，綠色熒光強(qiáng)度不斷加強(qiáng)(圖4)，但病毒載體對細(xì)胞具有一定的損害，尤其MOI為200 時最為明顯。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測感染效率(圖5)及各病毒MOI下綠色熒光蛋白表達(dá)量(表1)，綜合比較，MOI 為100 時，感染效率適宜，且對細(xì)胞損害最小，為最適MOI。

2.3 ELISA 及Western blotting 檢測軟骨相關(guān)蛋白表達(dá)

Ad介導(dǎo)BMP-4感染BMSCs組中Sox9(圖6A)、COLL Ⅱ(圖6B)和BMP-4(圖6C)表達(dá)量明顯高于空載病毒感染組和空白對照組(P<0.05)，空載病毒組和空白對照組間無明顯差異(P>0.05)?？梢?，感染后的BMSCS能持續(xù)高效表達(dá)BMP-4蛋白，并分泌軟骨細(xì)胞特有的COLL Ⅱ和Sox9 蛋白，促進(jìn)BMSCs 向軟骨細(xì)胞分化。Western blotting檢測可見Sox9 在感染后5 d 表達(dá)量增加明顯，COLLⅡ和BMP-4 在感染后7 d 表達(dá)量增加較明顯(圖6D、6E)(P<0.05)。

圖3 新西蘭兔原代BMSCs 成骨、脂肪、軟骨誘導(dǎo)分化Figure 3 Osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation of BMSCs from New Zealand rabbits

圖4 新西蘭兔BMSCs 在不同MOI 的病毒感染下熒光顯微鏡表現(xiàn)Figure 4 Fluorescence microscopic observation of BMSCs from New Zealand rabbits infected with different MOI of virus

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同MOI 的病毒感染新西蘭兔BMSCs 效率Figure 5 Detection of BMSCs in New Zealand rabbits infected with different MOI of virus by flow cytometry

表1 不同MOI 的病毒感染BMSCs 后綠色熒光蛋白表達(dá)量Table 1 The expression of green fluorescent protein in BMSCs infected with different MOI of virus

2.4 過表達(dá)BMP-4 對細(xì)胞增殖的影響

應(yīng)用CCK-8法檢測過表達(dá)BMP-4對細(xì)胞增殖的影響(表2)，各組細(xì)胞增殖活性隨時間推移都呈現(xiàn)增長趨勢。其中空白對照組和空載病毒組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.0 5)，可見MOI=100 時，病毒對細(xì)胞的增殖幾乎沒有影響。實(shí)驗(yàn)組增長趨勢與其他兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可見過表達(dá)BMP-4 能夠促進(jìn)體外BMSCs 增殖。

圖6 ELISA 及Western blotting 檢測新西蘭兔原代BMSCs 相關(guān)成軟骨蛋白表達(dá)Figure 6 Detection of chondrogenic protein expression related to primary BMSCs in New Zealand rabbits by ELISA and Western blotting

表2 過表達(dá)BMP-4 對新西蘭兔原代BMSCs 增殖的影響Table 2 Effect of BMP-4 overexpression on the proliferation of BMSCs

3 討論

應(yīng)用于軟骨組織工程的間充質(zhì)干細(xì)胞主要為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞和BMSCs。相對于其他間充質(zhì)干細(xì)胞而言，BMSCs 取材方便、來源充足、增殖分化能力強(qiáng)，自體和同種異體的BMSCs具備免疫抑制能力，是組織工程理想的種子細(xì)胞來源[2-3]。但BMSCs 在體內(nèi)含量極低，僅占骨髓單核細(xì)胞的0.001%～0.010%[4]?，F(xiàn)有的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法主要有全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞法和免疫磁珠法[5]。其中流式細(xì)胞法和免疫磁珠法對實(shí)驗(yàn)條件及操作要求高，需骨髓量大，且對于早期細(xì)胞貼壁及后期細(xì)胞增殖有一定影響；密度梯度離心法在細(xì)胞生長早期就能獲得高純度的單核細(xì)胞，但細(xì)胞易出現(xiàn)老化、增殖能力降低等情況；全骨髓貼壁法根據(jù)BMSCs 具有貼壁生長的特性，而紅細(xì)胞等雜細(xì)胞懸浮生長，通過換液傳代方式分離BMSCs，對細(xì)胞損害小，增殖能力在傳代中可保持穩(wěn)定，且早期培養(yǎng)液中存在的各種細(xì)胞及其分泌的相關(guān)細(xì)胞生長因子有利于保持BMSCs 生長微環(huán)境，促進(jìn)BMSCs 生長存活[6]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用全骨髓貼壁法，通過換液傳代成功實(shí)現(xiàn)了BMSCs 的體外擴(kuò)增。對于BMSCs 的鑒定，目前主要通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測表面分子標(biāo)志物來實(shí)現(xiàn)[7]，常用的表面因子包括呈陽性表達(dá)的CD44和CD29，以及陰性表達(dá)的CD34 和CD90[8-9]。本實(shí)驗(yàn)中CD29 和CD44 均呈高表達(dá)，CD34 和CD90 呈低表達(dá)；同時通過三系誘導(dǎo)分化證實(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞具備間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化潛能，進(jìn)一步證實(shí)通過全骨髓貼壁法能夠體外擴(kuò)增培養(yǎng)純度較高的BMSCs。

BMSCs 在向軟骨組織定向分化的過程中，需要多種細(xì)胞因子的共同調(diào)控，但單純加入細(xì)胞因子發(fā)揮作用的時間短，穩(wěn)定性差。此外，軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)時間過長，存在去分化現(xiàn)象。基因治療與骨組織工程相結(jié)合技術(shù)在臨床應(yīng)用中有廣闊前景[10-11]?；蛑委熥畲髢?yōu)點(diǎn)在于感染后的細(xì)胞自身可以持續(xù)、高效分泌目的蛋白，且分泌的蛋白含量接近人體生理需求量，克服了重組蛋白價(jià)格昂貴、半衰期短及存在細(xì)胞毒副作用的缺陷。有研究證實(shí)，利用縫隙連接蛋白43(CX43)基因重組慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，細(xì)胞CX43 表達(dá)量明顯增加[12]?；蛑委煹闹匾镔|(zhì)基礎(chǔ)是載體，目前用于軟骨組織工程中的基因載體主要有Ad 載體、慢病毒載體及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體針對的靶細(xì)胞為增殖期細(xì)胞，存在插入突變的風(fēng)險(xiǎn)[13]；慢病毒載體雖然能持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)目的基因，但存在基因突變、隨機(jī)插入的風(fēng)險(xiǎn)[14]；而Ad 載體感染率高，毒性低，靶細(xì)胞范圍廣泛，不與靶細(xì)胞發(fā)生基因整合。本研究在重組缺陷型Ad 載體介導(dǎo)下將BMP-4 基因?qū)隑MSCs，在克服BMP-4 半衰期短的缺陷的同時，實(shí)現(xiàn)了高活性成軟骨蛋白的持續(xù)高效釋放。

已有眾多研究證實(shí)，BMP 能作為起始信號，促使未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞向骨、軟骨細(xì)胞分化，誘導(dǎo)骨、軟骨[15]及神經(jīng)組織[16]的生成。其中除成軟骨因子BMP-2 外，BMP-4 能通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，誘導(dǎo)軟骨生成[17]。本實(shí)驗(yàn)將BMP-4作為主要調(diào)控因子，誘導(dǎo)BMSCs向軟骨分化，通過ELISA 及Western blotting 法證實(shí)了BMP-4 過表達(dá)可以促進(jìn)COLL Ⅱ、Sox9等特異性成軟骨蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞向軟骨組織分化。

綜上所述，Ad 介導(dǎo)BMP-4 感染BMSCS 后，細(xì)胞能夠持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)BMP-4、COLL Ⅱ及Sox9，促進(jìn)BMSCs 向軟骨細(xì)胞增殖及分化。但在實(shí)驗(yàn)中仍然發(fā)現(xiàn)一些問題：①BMSCs表面特異性標(biāo)志、多向分化的機(jī)制不明；②基因調(diào)控表達(dá)最佳量；③實(shí)驗(yàn)動物與人的差異性；④從動物模型到臨床應(yīng)用等。這些問題都有待進(jìn)一步研究。