邵慧敏， 張 匯， 向雨維， 楊 柳， 宋子波， 艾連中

（1. 上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2. 云南貓哆哩集團(tuán)有限責(zé)任公司，玉溪 653100）

羅望子（ Tamarindus indica L.） 是蘇木科（Caesalpiniaceae）酸豆屬（Tamarindus）的一種常綠大型喬木[1]，又稱(chēng)酸角、酸梅、酸豆、羅晃子、通血香等[2]，盛產(chǎn)于緬甸、孟加拉、印度、老撾等國(guó)[3]。羅望子果肉酸甜，可供食用，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。羅望子種仁含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%～73%非纖維碳水化合物、15%～20%蛋白質(zhì)、6%～8%脂肪、3%～5%纖維和2.5%～3.2%灰分[4]。研究表明，從羅望子種仁中提取的羅望子多糖是一種中性多糖[5]，具有凝水、穩(wěn)定、增稠、成膜、乳化等優(yōu)良的理化性質(zhì)[6-7]，且耐熱、耐酸、耐堿、耐凍，是一種理想的食品添加劑。羅望子多糖分子結(jié)構(gòu)為：主鏈?zhǔn)铅?D-1,4 糖苷鍵連接的葡萄糖，側(cè)鏈?zhǔn)铅?D-1,6 糖苷鍵連接的木糖和β-D-1,2 糖苷鍵連接的半乳糖[8]；其分子量在720～880 kDa[9]。在我國(guó)海南、云南、廣西、四川等地均有羅望子的栽培[10]，但其利用率極低，特別是對(duì)于羅望子多糖的開(kāi)發(fā)利用。

目前，我國(guó)只有少數(shù)報(bào)道研究了關(guān)于羅望子多糖的提取及優(yōu)化，如闞歡等[11]對(duì)料液比、pH 和沉降時(shí)間進(jìn)行研究，將羅望子多糖的得率提高至52%；郇延軍等[12]加入了酶解工藝，羅望子多糖的得率達(dá)到55%；而在王文光等[13]的研究中，優(yōu)化后的多糖得率可達(dá)70.2%。以上研究均以提取物得率為應(yīng)變量，并未驗(yàn)證其中多糖含量的高低，忽略了提取物中所含有的雜質(zhì)，無(wú)法真正反映出羅望子多糖的提取率。另外，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了羅望子多糖中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得超過(guò)3%，但國(guó)內(nèi)仍未有關(guān)于低蛋白羅望子多糖的研究。因此，本研究將綜合羅望子多糖提取率和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)兩個(gè)指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析法對(duì)羅望子多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以得到一種高效、經(jīng)濟(jì)的工藝，并獲得符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的羅望子多糖，為工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅望子種仁由云南貓哆哩公司提供。

葡萄糖、半乳糖、木糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Sigma 公司；無(wú)水乙醇、苯酚、硫酸、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸、硼酸購(gòu)于源葉生物。

1.2 儀器與設(shè)備

ME2002E 電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；FiveEasy pH 計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）；RCT 德國(guó)IKA 基本型加熱磁力攪拌器（德國(guó)IKA 公司）；Avanti JXN-26 智能型高效離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SP-752 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜）；FOSS 全自動(dòng)凱氏定氮儀Kjeltec 8400（瑞典FOSS 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取工藝

種仁去皮、粉碎、過(guò)篩后，按料液比1∶10 加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，室溫?cái)嚢? h 后，離心（8 000×g，20 min）并除去上清液，將沉淀置于烘箱（40 ℃，12 h）烘干，獲得除去小分子脂質(zhì)、色素等雜質(zhì)后的原料。

精確稱(chēng)取80 目原料5.0 g，按料液比1∶40 加入200 mL 去離子水，用1 mol/L 的檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH 至3.5，在磁力攪拌器上加熱至80 ℃，待溫度穩(wěn)定后，恒溫浸提20 min。將懸濁液靜置冷卻后離心（8 000×g，20 min），取上清液按體積比1∶1 倒入無(wú)水乙醇（一邊快速攪拌，一邊緩慢將乙醇倒入），使溶液的乙醇最終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%，4 ℃靜置2 h 后過(guò)濾、取沉淀，真空干燥（40 ℃，8 h）后即可得到粗多糖。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

原料目數(shù)：分別選擇10，40，80，120，160 目原料，在其他步驟不變的條件下進(jìn)行提取，測(cè)定多糖提取率和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

料液比：在獲得上述最優(yōu)條件的情況下，分別按料液比1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60加入100，150，200，250，300 mL 去離子水，在其他步驟不變的條件下進(jìn)行提取，測(cè)定多糖提取率和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

提取pH：在獲得上述最優(yōu)條件的情況下，分別調(diào)節(jié)溶液pH 至2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，在其他步驟不變的條件下進(jìn)行提取，測(cè)定多糖提取率和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

提取溫度：在獲得上述最優(yōu)條件的情況下，分別將溶液加熱至60，70，80，90，100 ℃，在其他步驟不變的條件下進(jìn)行提取，測(cè)定多糖提取率和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

提取時(shí)間：在獲得上述最優(yōu)條件的情況下，分別將溶液加熱10，20，30，40，50 min，在其他步驟不變的條件下進(jìn)行提取，測(cè)定多糖提取率和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 多糖提取率測(cè)定

采取苯酚硫酸法，測(cè)定粗多糖中的總糖含量。配制0.1 mg/mL 樣品溶液，取1 mL 加入0.5 mL體積分?jǐn)?shù)3%的苯酚溶液和5 mL 濃硫酸，振蕩后靜置20 min，在490 nm 處測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)曲測(cè)定總糖含量，并計(jì)算得到多糖提取率。

式中：η 為多糖提取率；a 為總糖百分含量；m1為粗多糖質(zhì)量，g；m0為原料質(zhì)量，g。

1.3.4 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

采用凱式定氮法[14]測(cè)定多糖中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)pro，蛋白質(zhì)換算系數(shù)為6.25。

1.3.5 響應(yīng)面分析

以單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，采用Design Expert 8.0.5 軟件中的Box-Behnken[15]實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，分別用X1，X2，X3表示3 個(gè)關(guān)鍵因素，分別以-1，0，1 編碼每一個(gè)自變量的低、中、高實(shí)驗(yàn)水平，以多糖提取率（Y1）和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（Y2）為響應(yīng)值。根據(jù)軟件給出的17 組不同提取條件提取多糖，并計(jì)算多糖提取率和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 原料目數(shù)對(duì)Y1，Y2 的影響

如圖1（a）所示，多糖提取率和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)都隨著原料目數(shù)的變化而顯著變化。其中多糖提取率隨目數(shù)的升高，先上升后下降，在120 目時(shí)達(dá)到最高值。而蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著目數(shù)的升高，先下降后上升，并且在120 目達(dá)到最低值，因此選擇120 目為最佳目數(shù)。

2.1.2 料液比對(duì)Y1，Y2 的影響

如圖1（b）所示，多糖提取率隨料液比的增加先略有上升后略有下降，但波動(dòng)較小，多糖提取率在料液比1∶40 時(shí)達(dá)到最高值。料液比對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響并不顯著，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在料液比1∶30 時(shí)達(dá)到最低值。因此，取1∶40 為最佳料液比，與王文光等[13]對(duì)最佳料液比的研究結(jié)果一致。

2.1.3 提取pH 對(duì)Y1，Y2 的影響

如圖1（c）所示，pH 對(duì)多糖提取率的影響較小，在pH 2.5～4.5 提取率波動(dòng)較小，在pH 升高至5.5 后提取率略有降低。而蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨pH 的變化較大，隨著pH 的降低，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)先降低后升高，并在pH 3.5 達(dá)到最低值，因此，綜合兩項(xiàng)應(yīng)變量，選擇pH 3.5 為最佳pH。

2.1.4 提取溫度對(duì)Y1，Y2 的影響

如圖1（d）所示，多糖提取率隨著提取溫度的升高，先升高后降低，并在90 ℃達(dá)到最大值。而其中的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)也是隨著溫度的升高，先升高后降低，但波動(dòng)較小。90 ℃和100 ℃的多糖提取率和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)都非常接近，而70 ℃的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)是顯著降低的，且從生產(chǎn)上來(lái)說(shuō)，100 ℃的成本和能耗也更高。

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)Y1，Y2 的影響

如圖1（e）所示，多糖提取率和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)并無(wú)顯著變化。多糖提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)先略有上升，后在50 min 時(shí)下降；蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時(shí)間的延長(zhǎng)稍有增加。因此，綜合多糖提取率、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及能耗情況來(lái)看，取20 min為最佳提取時(shí)間。

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與原料目數(shù)、提取pH 和提取溫度相比，料液比和提取時(shí)間對(duì)多糖提取率及蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響都不顯著，因此選擇原料目數(shù)、提取pH 和提取溫度為響應(yīng)面的三因素進(jìn)一步研究。采用Design Expert 8.0.5 軟件中的Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)羅望子多糖提取工藝進(jìn)行分析，并處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。響應(yīng)面的分析因素及水平見(jiàn)表1。

實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析及方程擬合見(jiàn)表3、表4。

根據(jù)多元回歸分析得到多糖提取率的回歸方程[16]：

圖1 不同因素對(duì)羅望子多糖提取率和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 Effect of different factors on the extraction yield and protein mass fraction of TSP

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Tab.1 Independent variables and levels for the response surface design

式中：A 表示原料目數(shù)；B 表示提取pH；C 表示提取溫度。

如表3 所示，模型的P＜0.000 1，表明回歸方程（2）極顯著。模型校正決定系數(shù)Radj2=0.973 0，表明有97.30%可用該模型解釋?zhuān)挥?.70%無(wú)法解釋。模型確定系數(shù)R2=0.989 9，表明實(shí)際值和預(yù)測(cè)值的相關(guān)性良好[17]，此二次回歸模型可用于分析羅望子多糖的提取率。由P 值可知，提取pH和提取溫度對(duì)多糖提取率的影響極顯著，原料目數(shù)對(duì)多糖提取率的影響顯著。由F 值可知[18]，各因素對(duì)多糖提取率的影響貢獻(xiàn)率為提取溫度最高，其次為提取pH，最后為原料目數(shù)。交互項(xiàng)AB 和BC 影響顯著，交互項(xiàng)AC 影響不顯著，說(shuō)明各影響因素對(duì)多糖提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。

表2 羅望子多糖提取響應(yīng)分析方案及結(jié)果Tab.2 Analysis scheme and results for the response surface design

根據(jù)多元回歸分析得到優(yōu)化提取工藝的回歸方程：

如表4 所示，模型的P＜0.000 1，表明回歸方程（3）極顯著。模型校正決定系數(shù)Radj2=0.993 7，表明有99.37%可用該模型解釋?zhuān)挥?.63%無(wú)法解釋。模型確定系數(shù)R2=0.998 0，表明實(shí)際值和預(yù)測(cè)值的相關(guān)性良好[16]，此二次回歸模型可用于分析羅望子多糖中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。由P 值可知，原料目數(shù)、提取pH 和提取溫度對(duì)多糖提取率的影響均為顯著。由F 值可知，各因素對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響貢獻(xiàn)率為提取溫度最高，其次為原料目數(shù)，最后為提取pH。交互項(xiàng)AB 影響顯著，交互項(xiàng)AC 和BC 影響不顯著，說(shuō)明各影響因素對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。

表3 羅望子多糖提取率的回歸模型方差分析Tab.3 Variance analysis variance for the fitted regression model of TSP yield

表4 羅望子多糖中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的回歸模型方差分析Tab.4 Variance analysis variance for the fitted regression model of protein mass fraction

2.2.2 交互作用分析

由圖2（a）可知，提取溫度不變時(shí)，固定原料目數(shù)，多糖提取率隨提取pH 的降低呈升高的趨勢(shì)；固定提取pH，多糖提取率隨原料目數(shù)的提高先升高后降低（P＜0.05）。由圖2（b）可知，提取pH 不變時(shí)，固定原料目數(shù)，多糖提取率隨提取溫度的升高呈升高的趨勢(shì)；固定提取溫度，多糖提取率隨原料目數(shù)的提高先升高后降低。由圖2（c）可知，原料目數(shù)不變時(shí)，固定提取溫度，多糖提取率隨提取pH 的降低呈升高的趨勢(shì)；固定提取pH，多糖提取率隨提取溫度的升高呈升高的趨勢(shì)（P＜0.05）。

圖2 兩因素的交互作用對(duì)羅望子多糖提取率和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Influence of response surface plots of variable parameters on the TSP yield and protein mass fraction

由圖2（d）可知，提取溫度不變時(shí)，固定原料目數(shù)，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨提取pH 的降低先降低后升高；固定提取pH，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨原料目數(shù)的提高先升高后降低（P＜0.05）。由圖2（e）可知，提取pH 不變時(shí)，固定原料目數(shù)，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨提取溫度的升高先升高后降低；固定提取溫度，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨原料目數(shù)的提高先降低后升高。由圖2（f）可知，原料目數(shù)不變時(shí)，固定提取溫度，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨提取pH 的降低先降低后升高；固定提取pH，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨提取溫度的升高先升高后降低。

2.2.3 響應(yīng)面分析最優(yōu)羅望子多糖提取工藝條件

通過(guò)Design Expert 8.0.5 軟件得出多糖提取率相對(duì)高且蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)低的工藝優(yōu)化方案。

優(yōu)化方案為：原料目數(shù)118 目，提取pH 3.06，提取溫度90 ℃，羅望子多糖提取率的理論值為49.76%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)理論值為1.00%。以此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際值為原料目數(shù)120 目，提取pH 3.1，提取溫度90 ℃，羅望子多糖提取率的實(shí)際值為49.59%±0.36%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)實(shí)際值為1.02%±0.05%，表明實(shí)驗(yàn)實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值相符度高，該模型具有實(shí)際意義。與國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的研究[3,11-13]相比，該模型以多糖提取率代替多糖得率，更為準(zhǔn)確地反映了產(chǎn)物中的多糖含量；且首次結(jié)合了多糖提取率和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)兩項(xiàng)指標(biāo)，對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，使其操作簡(jiǎn)便、成本低廉，為羅望子膠的大規(guī)模生產(chǎn)提供一定的參考和理論依據(jù)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)羅望子多糖提取工藝的研究，初步確定了影響羅望子多糖提取率的主要因素，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用了響應(yīng)面分析法，以高多糖提取率和低蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，對(duì)羅望子多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，從而得到的最佳工藝條件為：原料目數(shù)120 目，提取pH 3.1，提取溫度90 ℃，羅望子多糖提取率為49.59%±0.36%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.02%±0.05%，實(shí)驗(yàn)實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值相符度高，該模型具有實(shí)際意義。本實(shí)驗(yàn)所采用的提取工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，為羅望子膠的大規(guī)模生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。