林艷婷 莊育彬 張東東 胡丁旺 吳香新

（1.福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 福州 350122；2.福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院 福州 350004；3.福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 福州 350122）

ADP核糖焦磷酸水解酶（Nudt）基因編碼的蛋白質(zhì)屬于Nudix水解酶家族。Nudix盒存在于催化核苷二磷酸衍生物水解的多種酶家族中。這種酶是一種ADP核糖焦磷酸酶，催化ADP核糖水解為AMP和核糖-5-P。它需要二價(jià)金屬離子和完整的Nudix基序來進(jìn)行酶活化。當(dāng)前人源NUDT9基因在國內(nèi)外受到廣泛關(guān)注，已有科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了人源NUDT9基因編碼不同亞型的剪接轉(zhuǎn)錄變體。NUDT9是一高特異性的ADP-核糖水解酶，在人體細(xì)胞內(nèi)主要有兩種轉(zhuǎn)錄形式：NUDT9α和NUDT9β，其中NUDT9α是一種對(duì)ADP-核糖和IDP-核糖高選擇性的39kDa線粒體單體蛋白[1-3]，而在NUDT9β多肽上缺少線粒體信號(hào)肽，這一現(xiàn)象可能來自于NUDT9α的自剪切[3-4]。有研究表明NUDT9的N端結(jié)構(gòu)域并非水解酶活性必須有的[4]，在NCBIGenBank中，大鼠Nudt9基因也存在兩種變異體，似乎也存在人源NUDT9基因的這種現(xiàn)象。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)顯示其可與C17orf 215相作用，其復(fù)合物可阻止線粒體內(nèi)的過度糖基化[3-5]。在已有的研究顯示，陽離子通道TRPM2導(dǎo)致的鈣離子途徑細(xì)胞凋亡。而TRPM2細(xì)胞內(nèi)C末端結(jié)構(gòu)域與NUDT9極其相似，該通道的關(guān)閉被ADP-核糖的緩慢水解所控制[6-8]。原核表達(dá)作為結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究蛋白結(jié)構(gòu)的重要基礎(chǔ)，是結(jié)構(gòu)生物學(xué)家們不可缺少的研究技術(shù)，同時(shí)原核表達(dá)也是抗體制備的抗原來源，幫助研究人員制備單克隆抗體和多克隆抗體，一直以來原核表達(dá)載體的構(gòu)建在分子克隆實(shí)驗(yàn)中是不可或缺的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。本文主要是通過PCR方法擴(kuò)增小鼠Nudt9基因，將其克隆至原核表達(dá)載體，并進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定以及測序鑒定，進(jìn)而對(duì)測序結(jié)果的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。蛋白質(zhì)的各種結(jié)構(gòu)及修飾對(duì)于蛋白的生物學(xué)功能研究具有重要意義，當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)蛋白的信號(hào)肽、抗原肽、跨膜區(qū)域、結(jié)構(gòu)域、磷酸化及糖基化等蛋白特性都是蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能的重要基礎(chǔ)，生物信息學(xué)分析有助于引導(dǎo)科研人員探索蛋白的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料 質(zhì)粒pCMV-SPORT6-Nudt9（小鼠Nudt9基因，B086-C8）購自武漢淼靈生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠Nudt9基因克隆至表達(dá)載體 在原引物對(duì)的5'端添加酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，PCR擴(kuò)增得到小鼠Nudt9基因條帶，然后對(duì)條帶進(jìn)行回收純化。純化后的產(chǎn)物與pET-28a（+）載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切，及純化回收。酶切產(chǎn)物必須純化回收后方可進(jìn)行連接，使用T4 DNA Ligase置于4℃進(jìn)行過夜連接。再進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化及菌群擴(kuò)增，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定以及測序鑒定。將目的基因引物對(duì)與載體引物對(duì)進(jìn)行組合PCR鑒定，分別為Nudt9 Forward與Nudt9 Reverse、T7 promoter與T7 terminator、Nudt9 Forward與T7 terminator、Nudt9 Reverse與T7 promoter。PCR鑒定后，在擴(kuò)大菌群提取進(jìn)行酶切鑒定，分別為重組質(zhì)粒雙酶切及重組質(zhì)粒單酶切，完成后再送生物公司進(jìn)行測序，并根據(jù)正確的測序序列繪制重組pET28a-Nudt9圖譜。PCR引物序列見表1。

1.2.2 小鼠Nudt9基因的生物信息學(xué)分析 將小鼠Nudt9基因與NCBI基因庫中的基因序列進(jìn)行BLAST，確保獲取正確的小鼠Nudt9基因，并選取不同的模式生物NUDT9基因運(yùn)用DNATAR進(jìn)行同源性分析，具體選取斑馬魚 （Zebrafish nudt9-NM_213352.2）、 牛 （Cattle NUDT9 -NM_001101096.2）、雞 （Gallus XM_420546.6）、人（Human NUDT9-NM_024047.5）、大鼠（Norway rat Nudt9-NM_001006991.1）、 兔 （Rabbit NUDT9-XM_008267620.2）及 普 通 獼 猴 （Rhesus monkey NUDT9-NM_001261782.2）等7個(gè)物種的NUDT9基因。為對(duì)小鼠Nudt9蛋白的功能進(jìn)行預(yù)測分析，分別運(yùn)用Signal P 5.0 Server在線軟件分析信號(hào)肽、TMHMM分析跨膜區(qū)域以及SMART在線軟件分析結(jié)構(gòu)域，再采用MANMEN分析蛋白多肽的抗原肽、NetNGlyc 1.0 Server在線軟件分析N-糖基化位點(diǎn)以及NetPhos 3.1 Server軟件預(yù)測磷酸化位點(diǎn)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果 將目的基因引物對(duì)與載體引物對(duì)進(jìn)行組合的PCR鑒定結(jié)果見圖1，可見第1孔道有一條約為1 069 bp的條帶，第2孔道有一條約為1 295 bp的條帶，第3孔道有一條約為1 153 bp的條帶，第4孔道有一條約為1 208 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符合，說明目的基因插入載體的預(yù)期位置。

圖1 重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)在第3泳道即雙酶切的泳道中有一條約為1 055 bp的條帶，其余泳道在5 000 bp以上出現(xiàn)質(zhì)粒條帶，見圖2。

2.2 測序鑒定及基因序列的生物信息學(xué)分析 測序結(jié)果表明，小鼠Nudt9基因成功被克隆至表達(dá)載體pET-28a（+）上，重組pET28a-Nudt9圖譜見圖3。

2.2.1 小鼠Nudt9基因同源性分析 利用Snapgene軟件，截取小鼠Nudt9基因序列，目的基因片段大小為1 053 bp，與NCBIGenBank在線比對(duì)分析。并運(yùn)用DNAStar-MegAlign進(jìn)行同源性分析，建立遺傳進(jìn)化樹。由同源性分析表以及遺傳進(jìn)化樹可以發(fā)現(xiàn)，重組至pET28a載體上的小鼠Nudt9基因與基因庫中的同源性為100%。由圖4可知，小鼠（5）與大鼠（6）的同源性最高，為92.9%；除斑馬魚（1）和雞（3）外，同源性基本保持在82%以上，其中與人（4）的同源性為82.9%，這很有利于NUDT9基因開展實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員來說具有重要意義，便于基因的各項(xiàng)人源化研究。

表1 PCR鑒定相關(guān)引物

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

2.2.2 小鼠Nudt9基因的生物學(xué)分析 運(yùn)用DNAMAN軟件將小鼠Nudt9基因轉(zhuǎn)化為蛋白的氨基酸序列，該蛋白含有350個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為38.6 kDa，p I為6.74；因載體上有His標(biāo)簽及腸激酶消化位點(diǎn)，故重組表達(dá)蛋白大小為40.8 kDa。

2.2.2.1 信號(hào)肽預(yù)測 由圖5可知，該蛋白的信號(hào)肽約位于第1至第25個(gè)氨基酸，第26和第27個(gè)氨基酸可能就是信號(hào)肽剪切位點(diǎn)。

2.2.2.2 跨膜區(qū)域預(yù)測 由圖6可知，該蛋白不存在跨膜區(qū)域，大部分蛋白的氨基酸位于生物膜外部。

2.2.2.3 結(jié)構(gòu)域預(yù)測 由圖7可知，通過SMART在線軟件分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白位于約192到331位置處存在140個(gè)氨基酸左右的核酸水解酶結(jié)構(gòu)域。

2.2.2.4 抗原肽分析 利用DNAMAN軟件將基因翻譯成氨基酸序列，并分析小鼠Nudt9蛋白的抗原肽。由表2可知，該蛋白可能存在9條抗原肽，其中最長為29個(gè)氨基酸，最短為6個(gè)氨基酸。15個(gè)氨基酸以上的有5條，用于單克隆抗體制備已具備較多的選擇性。

圖3 原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Nudt9圖譜

圖4 小鼠Nudt9基因同源性分析

圖5 小鼠Nudt9蛋白氨基酸序列信號(hào)肽位點(diǎn)分析

2.2.2.5 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測 磷酸化是基因翻譯后修飾的重要活化方式，對(duì)小鼠Nudt9蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測，見圖8。在該蛋白上存在38個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸的磷酸化位點(diǎn)21個(gè)，蘇氨酸的磷酸化位點(diǎn)11個(gè)，酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)有6個(gè)。

2.2.2.6 N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測 利用在線軟件Net-NGlyc 1.0 Server對(duì)小鼠Nudt9蛋白的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析，有糖基化可能性的氨基酸約19個(gè)，達(dá)到閾值的糖基化位點(diǎn)有13個(gè)，見圖9。

3 討 論

1）經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定以及測序鑒定，本研究成功獲得小鼠Nudt9基因的原核表達(dá)載體，該重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Nudt9將被用于小鼠Nudt9蛋白的大腸桿菌表達(dá)，繼續(xù)開展結(jié)構(gòu)生物學(xué)和各類抗體的制備實(shí)驗(yàn)。

圖6 小鼠Nudt9蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測

圖7 小鼠Nudt9蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測

表2 小鼠Nudt9蛋白抗原肽分析

2）已有研究人員發(fā)現(xiàn)了人源NUDT9基因編碼不同亞型的剪接轉(zhuǎn)錄變體，在NCBI基因庫中已有三種轉(zhuǎn)錄變異體。這一現(xiàn)象存在于多種模式生物中，在查找不同物種的NUDT9基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)大鼠、雞、擬南芥等模式生物存在不同的mRNA變異體，但較長的序列一般都包含了較短的序列，有研究預(yù)測該基因似乎在生物體中存在自剪切現(xiàn)象，但機(jī)制尚不清楚[9]；在NCBI基因庫中存在第三種人源NUDT9（GenBank ID：NM_001248011.1），在該變異體上中間位置缺失96個(gè)核苷酸，是否存在類似于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激情況下IRE1對(duì)xbp-1的剪切現(xiàn)象[10]，尚待考查。在大鼠兩個(gè)變異體中，其中一條變異體序列被包含在另一條變異體中。在NCBI庫中查找雞和兔Nudt9的CDS（Coding sequence，編碼區(qū)）時(shí)，發(fā)現(xiàn)其mRNA有三種變異體，雖然有幾個(gè)堿基存在差異，但是有一條較長序列，已經(jīng)包含了其他兩條較短序列，情況與人源NUDT9基因相似，因而也可能存在自剪切及其他修飾的可能性。

3）同源性分析表明，小鼠Nudt9與人源NUDT9基因具有較高同源性，有助于研究人員開展人源化相關(guān)實(shí)驗(yàn)，搜索人源化基因在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上的研究。該蛋白的氨基酸序列含350個(gè)氨基酸，本研究預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在該多肽上存在信號(hào)肽，但不含有跨膜區(qū)域，可能不會(huì)存在較多的主動(dòng)跨膜行為；在其肽鏈上含有140個(gè)氨基酸左右的核酸水解酶結(jié)構(gòu)域，位于肽鏈的末端。從其抗原肽上來看，長度適中，有兩條抗原肽為26個(gè)和29個(gè)氨基酸，對(duì)于制備多克隆抗體，乃至單克隆抗體具有重要意義。

4）基因在經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)錄翻譯后，為發(fā)揮其蛋白功能會(huì)發(fā)生一些磷酸化或者糖基化，其中蛋白質(zhì)磷酸化是最常見、最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，它參與和調(diào)控生物體內(nèi)的許多生命活動(dòng)，通過蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化，調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)、細(xì)胞周期等諸多細(xì)胞過程[11]。本研究磷酸化位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，小鼠Nudt9蛋白上存在38個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可見其在細(xì)胞內(nèi)扮演著重要作用，值得深入研究。蛋白質(zhì)的糖基化是糖類在糖基轉(zhuǎn)移酶（Glycosyhransferase，GTs）的催化下以共價(jià)鍵的形式與肽鏈連接的過程[12]，近年來晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advanced Glycation End Products，AGEs）成為了全球醫(yī)學(xué)界最為熱門的領(lǐng)域之一，有眾多的科研機(jī)構(gòu)、大學(xué)、醫(yī)院以及制藥公司紛紛加入研究AGEs的行列，以期通過研究，緩解并治療人體的衰老和很多慢性退化型疾病的發(fā)生。由此產(chǎn)生的糖基化終末產(chǎn)物受體（Advanced Glycosylation End Product Specific Receptor，AGER）也是科研人員研究的重點(diǎn)，在小鼠Nudt9蛋白上游13個(gè)超過閾值的糖基化位點(diǎn)以及6個(gè)可能存在的糖基化位點(diǎn)，如此之多的糖基化位點(diǎn)對(duì)于形成AGEs是一種較大的威脅，值得關(guān)注。且在其與人源NUDT9基因同源性達(dá)82.9%的情況下，通過對(duì)該基因的研究，進(jìn)而拓展至人類疾病的研究具有重要意義。

圖8 小鼠Nudt9蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

圖9 小鼠Nudt9蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測