呂晶晶, 龔為進(jìn), 竇艷艷, 段學(xué)軍, 劉海芳, 張列宇, 席北斗, 于水利, 侯立安,4
1. 中原工學(xué)院能源與環(huán)境學(xué)院, 河南 鄭州 450007 2. 同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 上海 200092 3. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院, 北京 100012 4. 火箭軍后勤科學(xué)技術(shù)研究所, 北京 100190
廣大的農(nóng)村地區(qū),小規(guī)模的生豬養(yǎng)殖會(huì)產(chǎn)生養(yǎng)豬廢水,這類養(yǎng)豬廢水大多露天存放在泥坑塘中,從而變?yōu)槔淆g養(yǎng)豬廢水,老齡養(yǎng)豬廢水如果處理不當(dāng)會(huì)引發(fā)水體富營(yíng)養(yǎng)化。人工濕地、氧化塘和土壤滲濾等生態(tài)法是處理老齡養(yǎng)豬廢水的比較理想的模式,但是也存在易堵塞、不穩(wěn)定等問題。
土壤滲濾系統(tǒng)發(fā)生堵塞,會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)水力傳導(dǎo)系數(shù)降低,處理能力下降,影響出水水質(zhì)[1]。堵塞問題的產(chǎn)生大大降低了土壤滲濾系統(tǒng)的大范圍推廣和應(yīng)用[2]。堵塞已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,成為研究土壤滲濾、人工濕地等生態(tài)處理方法的熱點(diǎn)問題之一。本研究主要運(yùn)用紫外、紅外、三維熒光等光譜學(xué)分析方法和高通量測(cè)序的微生物學(xué)方法探討堵塞形成的機(jī)理,以期為解決土壤滲濾處理老齡養(yǎng)豬廢水時(shí)的堵塞問題提供科學(xué)依據(jù),擴(kuò)展土壤滲濾推廣應(yīng)用范圍。
采用日立F-7000型熒光分光光度計(jì)掃描污水中溶解性有機(jī)物(dissolved orgainic matter, DOM)的三維熒光圖譜前,首先根據(jù)所測(cè)污水中的總有機(jī)碳濃度(TOC)濃度,再對(duì)該TOC濃度對(duì)樣品進(jìn)行一定倍數(shù)的稀釋,使測(cè)定水樣的TOC處于一個(gè)合適的范圍(TOC=10 mg·L-1左右),從而得到比較有效的三維熒光圖譜。得到的三維熒光數(shù)據(jù)在進(jìn)行深度處理之前進(jìn)行歸一化處理,即原始數(shù)據(jù)除以TOC值。儀器參數(shù)設(shè)置: 激發(fā)光源為150 W氙弧燈,光電倍增管電壓為700 V,信噪比>110,掃描速度12 000 nm·min-1,激發(fā)和發(fā)射單色儀的狹縫寬度均為10 nm,響應(yīng)時(shí)間為自動(dòng)。測(cè)定時(shí)狹縫寬度均為5 nm,激發(fā)波長(zhǎng)范圍設(shè)為200~400 nm,發(fā)射波長(zhǎng)范圍設(shè)為280~500 nm,激發(fā)和發(fā)射光譜增量5 nm[3]。取適量進(jìn)出水濾液樣品在-20 ℃冷凍成冰塊后,-60 ℃抽真空冷凍干燥,將所得固體粉末樣品以質(zhì)量比1∶100與KBr(光譜純)混合均勻,在紅外燈下研磨,再于50~100 MPa下壓片測(cè)紅外光譜。采用美國(guó)Nicolet5DX傅里葉紅外光譜儀,掃描范圍在4 500~400 cm-1,分辨率4 cm-1,掃描次數(shù)16次[3]。采用UNICO/UV-4802型紫外分光光度計(jì),掃描波長(zhǎng)范圍為190~700 nm,掃描間距為1 nm。
試驗(yàn)裝置如圖1所示。反應(yīng)器為高50 cm,內(nèi)徑為4 cm的有機(jī)玻璃管,其中填充的土壤為北京市順義區(qū)試驗(yàn)基地內(nèi)表層土。
圖1 反應(yīng)裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of reaction device
試驗(yàn)用水為稀釋了10倍的老齡養(yǎng)豬廢水,進(jìn)水水質(zhì)情況如表1所示。廢水通過蠕動(dòng)泵提升進(jìn)入反應(yīng)器,水力負(fù)荷為6 cm·d-1,系統(tǒng)前端未加預(yù)曝氣系統(tǒng)。反應(yīng)器的初始水力傳導(dǎo)系數(shù)為3 m·d-1,隨后逐漸減小,運(yùn)行了10 d之后,水力傳導(dǎo)系數(shù)降為0.005 m·d-1,并且土壤表層存在積水,
表1 稀釋老齡養(yǎng)豬廢水水質(zhì)Table 1 The water quanlity of synthetic highammonia nitrogen waste water
土壤滲濾系統(tǒng)發(fā)生了堵塞。實(shí)驗(yàn)中取堵塞前、堵塞時(shí)和堵塞后的三次進(jìn)出水水樣,進(jìn)行光譜學(xué)分析,并取堵塞時(shí)的表層土壤、底層土壤和原位土壤做細(xì)菌和真菌的DNA編碼分別為16S,18S rDNA。
圖2(a)—(f)分別為用MATLAB R2009a處理過之后去除了拉曼散射和瑞利散射之后的DOM三維熒光圖譜。由圖2(a)—(f)可以直觀的看到,堵塞前后,土壤滲濾系統(tǒng)對(duì)DOM的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了很大影響。進(jìn)水中的DOM主要為類酪氨酸、類色氨酸和溶解性微生物副產(chǎn)物[見圖2(a),(c),(e)],屬于類蛋白物質(zhì),系統(tǒng)完全堵塞之前,經(jīng)過處理之后,DOM轉(zhuǎn)變?yōu)轭惛焕锼幔瑢儆陬惛迟|(zhì)類物質(zhì)。而當(dāng)系統(tǒng)發(fā)生了堵塞,DOM的組成基本不變,只是進(jìn)水中原本存在的類蛋白峰發(fā)生了微弱的紅移,有發(fā)生轉(zhuǎn)化的趨勢(shì),熒光峰的相對(duì)強(qiáng)度減弱,表明DOM的濃度減小。
研究表明,紫外-可見吸收光譜可以揭示DOM組成的宏觀信息。圖4為堵塞前后DOM的紫外-可見吸收特征光譜圖。表3為堵塞前后DOM的紫外-可見吸收光譜特征參數(shù)。a355m-1為波長(zhǎng)為355 nm處的吸光系數(shù)[9],通過公式a355=A355×2.303/L計(jì)算,其中A355為波長(zhǎng)355 nm對(duì)應(yīng)的吸光度,L為光程即比色皿寬度0.01 m;E253/E203為波長(zhǎng)253 nm處的吸光度與203 nm處的吸光度比值;SR為ln(275)~ln(295)和ln(350)~ln(400)擬合直線斜率的比值; SUVA254為波長(zhǎng)254 nm處單位DOC濃度的吸光度,通過公式SUVA254=100×A254/DOC計(jì)算;A226~250和A260~400分別為對(duì)波長(zhǎng)226~250 nm和波長(zhǎng)260~400 nm范圍內(nèi)的吸光度做面積積分所得的值[1]。
圖3 堵塞前后溶解性有機(jī)物傅里葉變換紅外光譜Fig.3 FTIR spectra of DOM before and after cloggings
a355為表征有色DOM濃度的重要指標(biāo),堵塞前、堵塞時(shí)及堵塞后系統(tǒng)對(duì)a355的去除率分別為17.26%,37.24%和48.08%,可見堵塞的發(fā)生對(duì)去除有色DOM濃度是有利的,這是由于堵塞使進(jìn)水的水力停留時(shí)間變長(zhǎng)所導(dǎo)致的。E253/E203可以代表有機(jī)質(zhì)芳香環(huán)上的取代基種類和程度,當(dāng)取代基中脂肪鏈含量越多時(shí)其值越小,當(dāng)取代基中羰、羥基、羧基及酯類含量增多時(shí),該值則變大,堵塞過程中,該值變小,表明DOM芳香環(huán)取代基中脂肪鏈的含量增多。SR值的大小與有機(jī)物分子量有關(guān),此值越大,有機(jī)物分子量越小,堵塞過程中,該值變小,表明有機(jī)物分子量變大。SUVA254值越大,EOM的芳香性就越大[2],其組分中包含的含苯環(huán)化合物就越多,堵塞發(fā)生后,該值變小,表明出水組分中含苯化合物減少。波長(zhǎng)226~250 nm處的吸收帶主要由不飽和π—π鍵產(chǎn)生,波長(zhǎng)260~400 nm處吸收帶主要由苯環(huán)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生,因此該波段吸收峰面積積分大小A226~250和A260~400能體現(xiàn)大分子苯環(huán)結(jié)構(gòu)變化信息,堵塞發(fā)生時(shí)這兩個(gè)值均變小,表明出水中大分子苯環(huán)結(jié)構(gòu)減少,這與其他幾個(gè)紫外吸收特征指標(biāo)結(jié)果相一致。
表2 堵塞前后傅里葉紅外光譜特征峰對(duì)應(yīng)的化合物和官能團(tuán)Table 2 Compounds and functional groups correspondingto the FTIR peaks before and after cloggings
圖4 堵塞前后DOM紫外-可見吸收特征光譜Fig.4 UV-Vis absorption spectra of DOMbefore and after cloggings
表3 堵塞前后溶劑性有機(jī)物的紫外-可見吸收光譜特征參數(shù)Table 3 UV-Vis absorption spectral characteristicparameters of DOM
注: a和b分別表示堵塞前進(jìn)、出水,c和d分別表示堵塞時(shí)進(jìn)、出水,e和f分別表示堵塞后進(jìn)、出水
為了闡釋堵塞發(fā)生的微生物學(xué)機(jī)理,取堵塞時(shí)的表層土壤S1、底層土壤X1,做了細(xì)菌和真菌的16S rDNA和18S rDNA,同原位土壤Y1的菌群進(jìn)行微生物多樣性分析比較。細(xì)菌16S樣品PCR擴(kuò)增引物為338F_806R,真菌18S樣品PCR擴(kuò)展引物為SSU0817F_1196R。PCR擴(kuò)增完成后進(jìn)行純化,并用Picogreen染料熒光計(jì)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量并均一化混勻,而后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序平臺(tái)為Illumina MiSeq,測(cè)序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成,部分生物信息分析在該公司的I-Sanger云平臺(tái)上完成。
本研究通過Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)來研究環(huán)境中微生物的多樣性。Simpson指數(shù)值越大,表明群落多樣性越低。Shannon值越大,表明群落多樣性越高。計(jì)算出細(xì)菌16S rDNA在OUT水平下原位土壤Y1、表層土壤S1、底層土壤X1的Simpson指數(shù)分別為0.004 4,0.057 3和0.004 0,Shannon指數(shù)分別為5.877 0,4.560 8和6.037 4; 真菌18S rDNA在OUT水平下原位土壤Y1、表層土壤S1、底層土壤X1的Simpson指數(shù)分別為0.105 2,0.328 8和0.097 9,Shannon指數(shù)分別為2.794 9,1.506 8和2.879 8。從Simpson指數(shù)來看,細(xì)菌16S rDNA的群落多樣性為X1>Y1>S1; 真菌18S rDNA的群落多樣性也為X1>Y1>S1。并且細(xì)菌的群落多樣性大于真菌的群落多樣性。堵塞時(shí)表層土壤S1的群落多樣性最低,分析認(rèn)為由于表層土壤受到進(jìn)水的沖擊負(fù)荷最大。底層土壤X1的群落多樣性最大,比原位土壤Y1的群落多樣性要大,表明土壤滲濾系統(tǒng)中的污水進(jìn)入土壤之后微生物群落多樣性增加,比較三者微生物群落組成特性,有可能揭示引發(fā)堵塞的主要微生物群落。
真菌中,S1樣品中綱一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要包括Gammaproteobacteria(相對(duì)豐度36.5%)γ-變形桿菌綱,Betaproteobacteria(13.4%)β-變形菌綱,Actinobacteria(11.5%)放線菌綱和Alphaproteobacteria(8.5%)α-變形菌綱; Y1樣品中綱一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要包括Actinobacteria(36.2%)放線菌綱,Alphaproteobacteria(18.7%)α-變形菌綱,Acidobacteria(8.7%)酸桿菌綱和Betaproteobacteria(7.2%)β-變形菌綱; X1樣品中綱一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要包括Actinobacteria(22.8%)放線菌綱,Acidobacteria(15.5%)酸桿菌綱,Alphaproteobacteria(12.8%)α-變形菌綱和Clostridia(10.4%)梭狀芽孢桿菌綱??梢姡龢悠吩诰V一級(jí)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌都含有Actinobacteria和Alphaproteobacteria兩類。S1樣品中屬一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要有Arenimonas(22.2%)鐵礦沙單孢菌,Ramlibacter(4.6%)分枝桿菌和Nannocystis(3.4%)納囊藻屬; Y1樣品中屬一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要有norank _c_Acidobacteria(6.0%)酸桿菌綱,norank _f_Nitrosomonadaceae(3.6%)亞硝化單胞菌屬和Gaiella(2.6%); X1樣品中屬一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要有norank_c_Acidobacteria(11.4%)嗜酸細(xì)菌屬,norank _c_KD4-96(3.7%)和Gracilibacter(2.8%)纖細(xì)桿菌屬。
細(xì)菌中,S1樣品中綱一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要包括unclassified_d_Eukaryota(相對(duì)豐度49.8%)真核生物綱,Intramacronucleata(40.0%)髓內(nèi)核瘤綱,Sordariomycetes(3.4%)糞殼菌綱和Eurotiomycetes(2.1%)散囊菌綱; Y1樣品中綱一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要包括Sordariomycetes(37.2%)糞殼菌綱,Dothideomycetes座囊菌綱(30.5%),Eurotiomycetes(10.0%)散囊菌綱和norank_k_Fungi(5.4%)真菌綱; X1樣品中綱一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要包括Sordariomycetes(45.6%)糞殼菌綱,norank_k_Fungi(13.6%)真菌綱,Dothideomycetes(11.6%)座囊菌綱和Eurotiomycetes(10.4%)散囊菌綱。可見,樣品Y1和X1在綱一級(jí)的優(yōu)勢(shì)真菌完全相同。S1樣品中屬一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要有unclassified_d_Eukaryota(49.8%)真核生物,norank_f_Colpodea(22.3%)有足類纖毛蟲和Pseudoplatyophyra(17.4%)假盤藻; Y1樣品中屬一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要有unclassified_o_Pleosporales(25.4%)格孢腔菌,norank _o_Sordariales(17.2%)糞殼菌和Fusarium(14.5%)鐮刀菌; X1樣品中屬一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要有norank _o_Sordariales糞殼菌(21.5%),unclassified_o_Sordariales糞殼菌(13.9%)和norank_k_Fungi(13.6%)真菌。
(1)系統(tǒng)完全堵塞之前,經(jīng)過處理之后,DOM轉(zhuǎn)變?yōu)轭惛焕锼?,屬于類腐殖質(zhì)類物質(zhì)。而當(dāng)系統(tǒng)發(fā)生了堵塞,DOM的組成基本不變,只是進(jìn)水中原本存在的類蛋白峰發(fā)生了微弱的紅移,有發(fā)生轉(zhuǎn)化的趨勢(shì),熒光峰的相對(duì)強(qiáng)度減弱,表明DOM的濃度減小。
(2)進(jìn)出水DOM主要成分為糖類、酚類、脂類、有機(jī)酸及芳香類有機(jī)物。堵塞的發(fā)生對(duì)去除有色DOM濃度是有利的,并且出水中大分子苯環(huán)結(jié)構(gòu)減少。
(3)反應(yīng)器發(fā)生堵塞時(shí),下層土壤樣品微生物多樣性要大于上層,細(xì)菌的群落多樣性要大于真菌的群落多樣性。土壤樣品中綱一級(jí)的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為Actinobacteria放線菌綱和Alphaproteobacteria α-變形菌綱的菌群,主要優(yōu)勢(shì)真菌為Sordariomycetes糞殼菌綱和Eurotiomycetes散囊菌綱的菌群。