李潔芝，鄧維琴，張其圣,3，楊國華，陳功,3，范智義， 陳相杰，周志帥，李恒

(1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，成都 611130；2.四川省丹丹郫縣豆瓣集團(tuán)股份有限公司， 成都 611732；3.四川東坡中國泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山 620030； 4.成都市丹丹川菜調(diào)味品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，成都 611730)

郫縣豆瓣擁有300多年的制作歷史，其醬香濃郁醇厚、色澤紅潤油亮、瓣粒酥脆、辣而不燥，被譽為“川菜之魂”[1]。按照GB/T 20560-2006《地理標(biāo)志產(chǎn)品 郫縣豆瓣》的要求[2]，蠶豆接種米曲霉后，經(jīng)制曲工藝制成甜瓣子，再將甜瓣子與辣椒醅混合發(fā)酵，得到郫縣豆瓣產(chǎn)品。由此可見，由米曲霉主導(dǎo)的甜瓣子發(fā)酵是郫縣豆瓣生產(chǎn)的關(guān)鍵工序，米曲霉的發(fā)酵性能在很大程度上決定了郫縣豆瓣產(chǎn)品的質(zhì)量品質(zhì)、生產(chǎn)成本和市場競爭力。目前，制曲菌種主要是滬釀3.042米曲霉，但單一使用該菌株發(fā)酵存在產(chǎn)生酶系不全等問題[3]，現(xiàn)階段國內(nèi)關(guān)于米曲霉發(fā)酵郫縣豆瓣的研究多集中于高酶活力米曲霉的選育鑒定、酶學(xué)特性及混菌制曲等方面[4,5]，對米曲霉發(fā)酵甜瓣子的理化指標(biāo)、感官指標(biāo)的研究報道較少。本文對比研究了7株高產(chǎn)蛋白酶、α-淀粉酶的米曲霉試驗菌株與滬釀3.042米曲霉制備甜瓣子的發(fā)酵性能差異，以期得到產(chǎn)酶能力強、理化指標(biāo)及感官指標(biāo)優(yōu)良的具有生產(chǎn)應(yīng)用潛能的郫縣豆瓣釀造專用米曲霉菌株。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

干蠶豆瓣、面粉、麩皮、食用鹽、黃豆粉等：均為市售。

實驗菌株：由本實驗室分離篩選的高產(chǎn)蛋白酶、α-淀粉酶米曲霉菌株(采用黃豆汁固體培養(yǎng)基保藏)，菌株編號分別為24M-1、21M-2、BM-2、19M-2、25M-1、18M-1、DM1；滬釀 3.042米曲霉：中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

黃豆汁固體培養(yǎng)基：將除雜后的黃豆浸泡4 h以上，煮沸5 h，用紗布過濾后取黃豆汁1 L(調(diào)整濾液至5 °Bé)，20 g可溶性淀粉，1 g磷酸二氫鉀，0.5 g硫酸鎂，0.5 g硫酸銨，20 g瓊脂，于121 ℃滅菌20 min。

麩皮培養(yǎng)基：分別稱量80 g麩皮、20 g黃豆粉、80 g 水，混合，浸潤后分裝。

甲醛、二硝基水楊酸試劑(DNS)、福林-酚試劑、氫氧化鈉、濃硫酸、鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀等化學(xué)試劑：均為分析純，購自成都市科龍化學(xué)試劑廠，由本實驗室配制。

1.2 主要儀器

GCMS-TQ8040(配有Agilent J & W 高分離度氣相色譜柱，柱長30 m，直徑 0.320 mm，膜0.25 μm)氣質(zhì)聯(lián)用儀 日本島津公司；SWDB204SD-01型分離機 北京中船綠洲機器有限公司；YP20002型電子天平 上海越平科學(xué)儀器制造有限公司；752G型紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器股份有限公司；BG-160型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司；PHSJ-4F型pH計 梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；SW-CJ-2F型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZF-75L-H型高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠。

2 工藝與方法

2.1 種曲制備

2.1.1 工藝流程

麩皮→加水潤濕→裝入三角瓶→滅菌→接種→培養(yǎng)→種曲。

2.1.2 工藝說明

2.1.2.1 接種、培養(yǎng)

用接種環(huán)刮取黃豆汁固體斜面培養(yǎng)基上的米曲霉孢子接種于麩皮培養(yǎng)基中，在30 ℃、濕度80%的條件下培養(yǎng)72 h，得到種曲。

2.1.2.2 種曲酶活測定

在接種時間達(dá)到24 h后，每間隔12 h取樣，進(jìn)行酸性蛋白酶、中性蛋白酶和α-淀粉酶活測定，至72 h結(jié)束制曲。

2.2 成曲制備

2.2.1 工藝流程

2.2.2 工藝說明

2.2.2.1 漂燙

脫掉殼的干蠶豆瓣，去除雜質(zhì)，放入適量沸水漂燙3 min，用冷水冷卻，過濾，備用。

2.2.2.2 接種制曲

加入 17%的面粉(根據(jù)干蠶豆質(zhì)量計算)，接種一定量的種曲以滿足蠶豆混合物中米曲霉量達(dá)到 106CFU/g的標(biāo)準(zhǔn)，在濕度90%、30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，每12 h翻曲一次。

2.3 甜瓣子的制備

2.3.1 工藝流程

成曲→加入適量鹽水→搖勻→培養(yǎng)→發(fā)酵→甜瓣子。

2.3.2 工藝說明

將成曲稱重裝入三角瓶中，備用；將水加熱至80～90 ℃時加入食鹽，配成鹽水，冷卻備用；按成曲與水的質(zhì)量比為1∶1，將冷卻至40 ℃的鹽水(食鹽水的濃度以最終混合物的食鹽濃度為 15%確定)加入到裝有成曲的三角瓶中，拌和混勻，以紗布和牛皮紙封口，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d。每3 d用無菌玻璃棒攪拌1次，測定其氨基酸態(tài)氮、總酸、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量，并對制作成熟的甜瓣子進(jìn)行感官評價。

2.4 指標(biāo)測定

2.4.1 蛋白酶和α-淀粉酶

蛋白酶的測定方法：參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》[6]，進(jìn)行蛋白酶的測定。

α-淀粉酶的測定方法：參照GB/T 5521—2008《糧油檢驗 谷物及其制品中α-淀粉酶活性的測定 比色法》[7]，進(jìn)行α-淀粉酶活性的測定。

2.4.2 氨基酸態(tài)氮

氨基酸態(tài)氮的測定方法：參照GB 5009.235—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[8]，進(jìn)行氨基酸態(tài)氮的測定。

2.4.3 總酸

總酸的測定方法：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[9]，進(jìn)行總酸的測定。

2.4.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定方法：采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)，測定甜瓣子中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[10]，相對含量采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，采用3-甲基丁醇為內(nèi)標(biāo)物。

2.4.5 感官評定

對甜瓣子進(jìn)行感官評定，由10名人員組成感官評定小組，取其平均值。擬定的參考評定方法見表 1。

表1 甜瓣子發(fā)酵過程中的感官品質(zhì)Table 1 Sensory quality of sweet beans in the process of fermentation

3 結(jié)果與討論

3.1 種曲酸性蛋白酶、中性蛋白酶及α-淀粉酶酶活力測定結(jié)果分析

圖1 菌株產(chǎn)酶能力比較Fig.1 Comparison of enzyme production activity of strains

蛋白酶是米曲霉所產(chǎn)酶系中最重要的酶之一，直接影響原料的蛋白質(zhì)利用率和最終產(chǎn)品的風(fēng)味[11]。制曲過程中米曲霉產(chǎn)生的淀粉酶系，可將原料中的淀粉質(zhì)水解成糊精、麥芽糖和葡萄糖，與豆瓣醬的色澤和風(fēng)味形成有很大關(guān)系[12]。由圖1可知，24M-1、BM-2、DM1 3株試驗菌株分別在產(chǎn)酸性蛋白酶、中性蛋白酶和α-淀粉酶方面表現(xiàn)突出，酶活分別為816.809，2168.570，2490.18 U/g，高于3.042的產(chǎn)酶水平。其中，BM-2、24M-1種曲的中性蛋白酶、酸性蛋白酶活力最高，說明菌株產(chǎn)蛋白酶的能力較強，原料利用率更高，發(fā)酵周期更短；DM1種曲的α-淀粉酶酶活力最高，說明菌株分解原料中淀粉的能力較強，生成的果糖、葡萄糖等成分為其他微生物的生長提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，對后期發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)的形成起到關(guān)鍵作用。由此，BM-2、24M-1、DM1可作為備選菌株。

3.2 甜瓣子氨基酸態(tài)氮測定結(jié)果分析

圖2 甜瓣子氨基酸態(tài)氮含量對比Fig.2 Comparison of amino acid nitrogen content in sweet beans

甜瓣子制備過程中，依靠米曲霉等微生物在原料上生長繁殖所分泌的蛋白酶，將蛋白質(zhì)水解為氨基酸類物質(zhì)，通常以氨基酸態(tài)氮表示，是郫縣豆瓣鮮味的主要來源及部分色素(瓣子呈色)的生成基礎(chǔ)，其含量直接影響產(chǎn)品的風(fēng)味[13]，亦可作為衡量菌株發(fā)酵性能的重要指標(biāo)[14]。由圖2可知，發(fā)酵第19天和第29天，BM-2和24M-1的甜瓣子氨基酸態(tài)氮含量最高，其次為3.042和DM1。綜合分析，7株試驗菌株中，24M-1、BM-2、DM1發(fā)酵甜瓣子的氨基酸態(tài)氮含量較高，原料全氮利用率較高，鮮味較足，可作為備選菌株。

3.3 甜瓣子總酸含量測定結(jié)果分析

圖3 甜瓣子第19天和第29天總酸含量對比Fig.3 Comparison of total acids content in sweet beans on the 19th and 29th days

甜瓣子發(fā)酵過程中，乳酸菌等微生物代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸，導(dǎo)致有機酸逐漸積累，酸度逐漸增加。甜瓣子中含有適當(dāng)?shù)挠袡C酸可增加風(fēng)味和香氣，但含量過高則會影響蛋白酶、淀粉酶的分解，導(dǎo)致豆瓣呈酸味而影響最終產(chǎn)品品質(zhì)[15]。由圖3可知，全部菌株發(fā)酵甜瓣子中總酸的含量均低于2 g/100 g。綜合分析，7株米曲霉試驗菌株及對照菌株發(fā)酵甜瓣子的總酸均較為適宜，對產(chǎn)品品質(zhì)沒有不良影響。

3.4 甜瓣子中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定結(jié)果分析

表2 甜瓣子中揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果Table 2 Analysis results of volatile components in sweet beans by GC-MS

續(xù) 表

續(xù) 表

注：“—”表示未檢出，下同。

由表2可知，8株菌株發(fā)酵制備的甜瓣子中共測出65種相對含量較高的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中有醇類15種，酯類23種，酮類7種，醛類7種，酚類4種，酸類4種，烷烴類4種，腈類1種，與已有的研究結(jié)果一致[16]。

8個甜瓣子樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類對比情況見圖4。

圖4 各甜瓣子中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類對比Fig.4 Comparison of types of volatile flavor components in sweet beans

酯類主要由醇類與酸類的酯化反應(yīng)生成，通常呈現(xiàn)出令人愉悅的甜香及果香，除此之外，酯類還可掩蓋游離脂肪酸帶來的不愉快氣味[17]。由圖4可知，7株米曲霉菌株發(fā)酵甜瓣子中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類均高于對照菌株3.042，表現(xiàn)最突出的為DM1，共測出42類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類物質(zhì)就含有17種，其次為BM-2、24M-1、21M-2。

8個甜瓣子樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量對比情況見表3。

表3 甜瓣子主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量對比Table 3 Comparison of content of main volatile flavor components in sweet beans ng/g

醇類是構(gòu)成郫縣豆瓣特征風(fēng)味的一類重要化合物，可以被氧化成醛類、酸類等，還是酯化反應(yīng)的重要前體物質(zhì)[18,19]。醛類酮類物質(zhì)通常呈現(xiàn)出令人滿意的甜香及花果香，被認(rèn)為可以增強食品的風(fēng)味品質(zhì)[20]。由表3可知，各甜瓣子中，酮類、酚類的含量相對較高，其中，DM1甜瓣子中這兩類物質(zhì)含量均為最高，分別為5.31，8.20 ng/g，其次為21M-2甜瓣子，酮類、醇類含量分別達(dá)到4.05，5.90 ng/g；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量最高的為DM1，達(dá)到17.377 ng/g，其次為21M-2，為12.076 ng/g；7株米曲霉試驗菌株中，除19M-2外，其余菌株發(fā)酵甜瓣子的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量均高于對照菌株3.042。綜合來看，DM1和21M-2在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)方面較為突出，可作為備選菌株。

3.5 感官評定結(jié)果分析

對甜瓣子感官品質(zhì)進(jìn)行評定，結(jié)果見表4。

表4 發(fā)酵29 d的8個甜瓣子的感官評定表Table 4 Sensory evaluation of 8 sweet beans fermented for 29 days

由表4可知，8個甜瓣子中，最高分是24M-1樣品88分，其次是DM1、3.042?？芍囼灳?4M-1、DM1發(fā)酵制備的甜瓣子感官評價較高，優(yōu)于對比菌株3.042，可作為備選菌株。

4 結(jié)論

本研究以本實驗室分離鑒定得到的7株高產(chǎn)中性蛋白酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶的米曲霉菌株為試驗菌株，以市售3.042米曲霉為對照菌株，分別制備種曲、成曲、甜瓣子，考察了不同菌株發(fā)酵的種曲中的中性蛋白酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶的酶活力差別，進(jìn)一步評價了由上述8株菌株制作的種曲發(fā)酵的甜瓣子的氨基酸態(tài)氮、總酸、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、感官評價等發(fā)酵特性指標(biāo)。通過對比分析發(fā)現(xiàn)，24M-1、BM-2、DM1 3株菌株分別在產(chǎn)酸性蛋白酶、中性蛋白酶和α-淀粉酶等方面表現(xiàn)突出，甜瓣子中氨基酸態(tài)氮含量較高；全部菌株發(fā)酵甜瓣子中總酸的含量均較為適宜，對產(chǎn)品品質(zhì)沒有不良影響；揮發(fā)性香味物質(zhì)方面，通過GC-MS方法共分離鑒定出65種主要的揮發(fā)性化合物，酮類、醇類的含量相對較高，表現(xiàn)最突出的為DM1，共測出42類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，酯類達(dá)17種；感官評價方面，24M-1、DM1的感官評價最高，優(yōu)于對比菌株3.042。總體來看，編號為24M-1、DM1的兩株菌在種曲酶活力和甜瓣子的氨基酸態(tài)氮、總酸、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及感官評價等方面表現(xiàn)優(yōu)異，在提高原料利用率、加快發(fā)酵周期、提升豆瓣醬品質(zhì)方面有較好的應(yīng)用前景，可進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件和發(fā)酵工藝參數(shù)，并盡快應(yīng)用于郫縣豆瓣加工，改變目前產(chǎn)業(yè)專用生產(chǎn)菌株缺乏的局面。