梁天一，曾曉房，董浩，白衛(wèi)東，楊娟*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣州 510225；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，哈爾濱 150028)

厚味(thick taste)指的是食物中的厚味物質(zhì)和基本的味道物質(zhì)之間的相互作用，使食物中鹽的味道、鮮味和甜味等基本的味覺感受更加明顯，并且使食物本身具有厚實、持久、飽滿、鮮明的綜合味道，常用mouthfulness，long-lastingness，complexity等表達(dá)[1]。目前為止，能引起食物厚味風(fēng)味的這類γ-谷氨酰肽主要有γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Met等[2]。研究表明，γ-谷氨酰肽的合成通常是γ-谷氨酰二肽的配位，并且是最常見的酶進(jìn)入方法。 與γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶(GGT，EC 2.3.2.2)和谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)顯著相關(guān)[3-7]。GGT酶和谷氨酰胺酶用于合成γ-谷氨酰肽的最佳轉(zhuǎn)肽溫度均為37 ℃，最佳pH值在9～10.5之間，以谷氨酰胺為γ-谷氨酰的供體，氨基酸作為γ-谷氨酰的受體，其中苦味氨基酸通過催化轉(zhuǎn)化為γ-谷氨?；问胶?，其苦味消失、厚味生成。幾乎所有的GGT酶均可以用于合成γ-谷氨酰肽，包括γ-Glu-Val、γ-Glu-Leu和γ-Glu-Glu等已被成功合成。只有部分谷氨酰胺酶的微生物來源可用于捕獲γ-谷氨酰肽合成，如米曲霉源谷氨酰胺酶、硝基還原假單胞源谷氨酰胺酶和解淀粉芽孢桿菌源谷氨酰胺酶等，包括γ-Glu-Gln、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Val、γ-Glu-Gly等γ-谷氨酰二肽的合成。幾乎所有苦味氨基酸均通過GGT酶或者谷氨酰胺酶催化轉(zhuǎn)化為γ-谷氨酰二肽，而尚未見異亮氨酸通過γ-谷氨?；铣搔?Glu-Ile的反應(yīng)。所以，本研究試圖用一株商用的解淀粉芽孢桿菌源谷氨酰胺酶進(jìn)一步催化異亮氨酸轉(zhuǎn)化為厚味γ-Glu-Ile。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料與試劑

谷氨酰胺酶：日本天野酶制品株式會社；纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸：購于精科試劑公司；γ-Glu-Ile：購于上海雅心生物技術(shù)有限公司；乙腈、純甲醇：購于天津市百世化工有限公司；商用的雞肉湯粉、各種調(diào)味品、感官標(biāo)準(zhǔn)品(食品級)：購于佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

SHZ-88水浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市國旺儀器廠；MF1204C型電子天平 上海歐萊博實驗室器材供應(yīng)商；PHS-3E pH計 杭州美尼特儀器自動化儀表有限公司；LGJ-12立式真空冷凍干燥機 北京松源華興生物技術(shù)股份有限公司；AVANCE III HD 600超導(dǎo)核磁共振波譜儀 德國Bruker 公司；島津LC 20-A型高效液相色譜儀 杭州瑞析科技有限公司；Biochrom 30+ 全自動氨基酸分析儀 大昌洋行(上海)有限公司；島津LC10ATVP高效液相色譜儀 島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 解淀粉芽孢桿菌源谷氨酰胺酶酶法合成γ-Glu-Ile

考慮將GGT酶作為合成γ-谷氨酰肽底物參數(shù)的催化劑：將200 mmol/L谷氨酰胺(供體氨基酸)與100 mmol/L異亮氨酸混合，調(diào)節(jié)pH至10.0，加入0.05 U/mL谷氨酰胺酶作為反應(yīng)的起始點。 反應(yīng)在友聯(lián) HH-4恒溫水浴中于37 ℃進(jìn)行4 h，然后將酶用沸水浴在100 ℃下懸浮20 min滅活。采用LGJ-12立式真空冷凍干燥機對反應(yīng)液進(jìn)行冷凍干燥，備用。酶法合成γ-Glu-Ile的方法優(yōu)化：變化底物濃度比、pH值和溫度等條件，獲得最佳的γ-Glu-Ile酶促反應(yīng)條件。

1.2.2 酶促反應(yīng)液中氨基酸含量的測定

使用Biochrom 30+自動氨基酸分析儀測定每種酶促反應(yīng)溶液中游離氨基酸的含量。 將適當(dāng)?shù)臉悠敷w積溶解在超純水中，攪拌并均勻混合，使氨基酸在室溫下靜置30 min，然后置于50 mL容量瓶中; 定容后取4 mL樣品，取樣品∶磺基水楊酸(15%)為 4∶1加入磺基水楊酸，混合均勻，并在4 ℃冷藏60 min；將溶液在4 ℃下以1000 r/min離心15 min，然后將上清液進(jìn)行再次離心，將上清液通過0.22 μm過濾器過濾并在氨基酸分析儀上檢測。

1.2.3 HPLC法定性定量檢測產(chǎn)物

參考Suzuki等人的方法，采用島津LC10ATVP高效液相色譜儀對可在每個反應(yīng)中合成的γ-谷氨酰肽進(jìn)行進(jìn)一步實驗。通過XSelect HSS T3 柱(5 μm， 4.6 mm×250 mm，Waters，USA)分離γ-谷氨酰肽。標(biāo)準(zhǔn)方法是0.1%甲酸-乙腈(A)和0.1%甲酸-水溶液(B)。洗脫梯度，操作參數(shù)為90% B+10% A，然后以85% B+15% A，再次洗脫5 min，如果20% B+80% A，在5 min之后，回到90% B+10% A并將此等級設(shè)定為25 min；日立L-7100紫外掃描儀(Hitachi，Tokyo，Japan)用于檢測。在220 nm處，將柱溫設(shè)定為40 ℃以將進(jìn)樣量體積增加至10 μL。擴(kuò)增的γ-谷氨酰肽片段，使用LGJ-12冷凍干燥反應(yīng)序列以檢測同一性。

1.2.4 NMR鑒定γ-Glu-Ile結(jié)構(gòu)

參考Suzuki等人的方法，采用布魯克AVANCE III HD 600型超導(dǎo)核磁共振波譜儀對γ-谷氨酰肽進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)鑒定。將5 mg凍干樣(高效液相色譜分離后餾分中的目標(biāo)γ-谷氨酰肽)溶入適量的重水里，之后送入超導(dǎo)核磁共振波譜儀進(jìn)行氫譜鑒定。利用MestReNova 9.0 Reader 核磁共振分析專用軟件對圖譜進(jìn)行分析。

1.2.5 γ-Glu-Ile改善和增強常見食品的呈味效果

將一定濃度的γ-Glu-Ile溶液分別添加到適度稀釋的商用雞湯、牛肉湯或者醬油中。通過五分評分制評價γ-Glu-Ile對這3種食物的鮮味、厚味、酸味和甜味的增加效果。在專業(yè)敏感評估小組中，選出了15名經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的感官評估人員(8男7女，年齡在23～35歲之間，其中7人的感官評估經(jīng)驗超過2年)。對于味道評估，感官評估室的溫度固定在(23±2) ℃。每個評估員品嘗10 mL的樣品，將樣品放入口中25 s，然后慢慢吞咽。評估樣品后，評估員應(yīng)用純水沖洗口腔，然后品嘗下一個樣品，記錄每個樣品的原始味道分?jǐn)?shù)。

采用滋味稀釋分析法和三選一實驗(three-alternative forced-choice)對γ-Glu-Ile在雞湯、牛肉湯和醬油中的厚味閾值進(jìn)行評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ-Glu-Ile的定性定量檢測

采用島津LC 20-A型高效液相色譜儀對反應(yīng)液進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果見圖1。

圖1 反應(yīng)混合物的HPLC色譜圖，插入目標(biāo)產(chǎn)物的NMR光譜Fig.1 HPLC chromatogram of the reaction mixture, inserted NMR spectrum of the target product

注：在pH 7.5和37 ℃的條件下用100 mmol/L Ile，200 mmol/L Gln和0.05 U/mL谷氨酰胺酶進(jìn)行反應(yīng)。

由圖1可知，酶促反應(yīng)液中目標(biāo)組分均在10 min內(nèi)得到良好分離。其中，目標(biāo)產(chǎn)物γ-Glu-Ile的出峰時間為7.550 min，分辨率均大于2.0，分離度大于99.7%。由結(jié)果得出解淀粉芽孢桿菌源谷氨酰胺酶可以催化γ-谷氨酰二肽的合成，與米曲霉源谷氨酰胺酶催化γ-谷氨酰二肽合成的轉(zhuǎn)化率接近。通過外標(biāo)法對各產(chǎn)物進(jìn)行了定量分析，各個標(biāo)準(zhǔn)品的回收率在96%～105%之間，精密度測定的結(jié)果顯示低于1%，說明此方法可用于γ-谷氨酰二肽的定量分析。

圖2 谷氨酰胺酶催化的γ-Glu-Ile合成Fig.2 The synthesis of γ-Gln-Ile catalyzed by glutaminase

注：將含有200 mmol/L Gln和100 mmol/L Ile(pH 10.0)和谷氨酰胺酶(0.05 U/mL)的反應(yīng)混合物在37 ℃下孵育12 h。 通過HPLC測定反應(yīng)混合物中γ-Glu-Ile和Ile的量隨時間的變化。

由圖2可知，在反應(yīng)的前10 h內(nèi)，γ-Glu-Ile的產(chǎn)量隨著反應(yīng)時間的延長而不斷增加，而后隨著反應(yīng)時間延長，產(chǎn)率基本不變，最大產(chǎn)量為10.79 mmol/L。底物(異亮氨酸)的含量隨著反應(yīng)時間延長而減少，到反應(yīng)結(jié)束，異亮氨酸殘余量為49.43 mmol/L。底物殘余量與產(chǎn)物產(chǎn)量間存在極大差異，暗示有副產(chǎn)物的產(chǎn)生。GGT酶在催化γ-谷氨酰二肽合成的過程中，類似γ-Glu-γ-Glu-Tau或聚谷氨酸等物質(zhì)通常被定義為副產(chǎn)物檢出[8]。谷氨酰胺酶在催化底物氨基酸轉(zhuǎn)化為γ-谷氨酰二肽的過程中也有γ-[Glu]n-AA的產(chǎn)生[9]。

對目標(biāo)產(chǎn)物(γ-Glu-Ile)凍干樣進(jìn)行超導(dǎo)核磁共振波譜儀分析，結(jié)果見圖1。(1H NMR (600 MHz, D2O) )：δ 4.21 (d, J = 5.9 Hz, 1H, α-CH Ile),3.93 (t, J=6.5 Hz, 1H, α-CH Glu),2.54～2.42 (m,2H,γ-CH2Glu), 2.19～2.06 (m, 2H, β-CH2Glu),1.91～1.81 (m,1H,β-CH Ile),1.44～1.34 (m, 1H),1.22～1.12 (m,1H),0.87 (d, J =6.9Hz,3H),0.82 (t, J=7.4 Hz, 3H)。以上數(shù)據(jù)中γ-谷氨酰二肽的核磁數(shù)據(jù)與Suzuki團(tuán)隊利用GGT酶合成的γ-谷氨酰二肽結(jié)構(gòu)一致。

2.2 γ-Glu-Ile產(chǎn)量的優(yōu)化

圖3 底物濃度(A)、pH值(B)和溫度(C) 對γ-Glu-Ile合成的影響Fig.3 The effect of substrate concentration (A), pH value (B) and temperature (C) on γ-Glu-Ile synthesis

注：A表示Gln∶Ile，0.05 U/mL谷氨酰胺酶在pH 9.5和37 ℃下反應(yīng)10 h。B表示Gln∶Ile 為100∶200(mmol/L∶mmol/L)，0.05 U/mL谷氨酰胺酶，pH 9.5，10 h；C表示Gln∶Ile為100∶200(mmol/L∶mmol/L)，0.05 U/mL谷氨酰胺酶，pH 9.5，10 h。

由圖3中A可知，Gln與Ile的摩爾濃度比對γ-Glu-Ile的產(chǎn)量具有一定的影響，根據(jù)Suzuki等人的試驗，設(shè)定Gln和Ile的濃度比為：200∶100、100∶150、100∶200、200∶200、300∶200 (mmol/L∶mmol/L)。由圖3中A可知，隨著異亮氨酸含量的增加，γ-Glu-Ile產(chǎn)量增加，而γ-Glu-Ile的含量不隨谷氨酰胺酶含量的變化而變化，說明受體氨基酸的變動對γ-Glu-Ile的產(chǎn)生具有一定的決定作用。最佳的Gln∶Ile為100∶200(mmol/L∶mmol/L)，γ-Glu-Ile的最大產(chǎn)量為18.57 mmol/L，此結(jié)果與米曲霉源谷氨酰胺酶催化合成γ-谷氨酰二肽的結(jié)果接近。由圖3中B可知，γ-Glu-Ile的產(chǎn)生表現(xiàn)出pH 8～11范圍內(nèi)的依賴性，最適pH值在9～10之間，高于或低于此區(qū)間均不利于γ-Glu-Ile的產(chǎn)生，γ-Glu-Ile的產(chǎn)量為21.58 mmol/L。 由圖3中C可知，溫度對酶活的影響導(dǎo)致其催化γ-Glu-Ile產(chǎn)生量的差異，由結(jié)果可知，此酶催化γ-Glu-Ile合成的最適溫度為37 ℃，最高產(chǎn)量為21.58 mmol/L。綜上可知，此解淀粉芽孢桿菌源谷氨酰胺酶催化γ-Glu-Ile合成的最適底物濃度比為Gln∶Ile為100∶200(mmol/L∶mmol/L)，最適pH值在9～10之間，最適溫度為37 ℃，反應(yīng)時間為10 h，最大產(chǎn)量為21.58 mmol/L。

2.3 γ-Glu-Ile對食物的增味效果

圖4 γ-Glu-Ile對A空白雞肉湯(BCB)、B空白 牛肉湯(BBB)和C醬油(SS)的影響Fig.4 The effect of γ-Glu-Ile on A blank chicken broth (BCB), B blank beef broth (BBB) and C soy sauce (SS)

表1 γ-谷氨酰肽的Kokumi閾值濃度Table 1 Kokumi threshold concentration of γ-glutamyl peptides

γ-Glu-Ile已被報道具有厚味，在發(fā)酵面團(tuán)和醬油中均有發(fā)現(xiàn)[10,11]。眾所周知，將厚味γ-谷氨酰肽添加到食物中，可以增加食物的鮮、甜、咸等基本味和濃厚味[12,13]. 因此，本文試圖將厚味γ-Glu-Ile添加到雞湯、牛肉湯等物質(zhì)中，用以評價γ-Glu-Ile對這些食物滋味的改善效果，以判斷γ-Glu-Ile是否可以被用作食品添加劑。由圖4可知，將適量γ-Glu-Ile添加到雞湯、牛肉湯或者醬油中，評價雞湯、牛肉湯和醬油的鮮味、厚味、酸味和甜味的改變情況，得出γ-Glu-Ile可以增加雞湯、牛肉湯和醬油的鮮味、厚味、酸味和甜味(p<0.05)，此結(jié)果說明厚味γ-Glu-Ile可以作為呈味添加劑用于增加雞湯、牛肉湯和醬油等食物的味感。事實上，類似的厚味γ-谷氨酰肽，如γ-Glu-Gly、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Gln、γ-Glu-His、γ-Glu-Val、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Met、γ-Glu-Val-Gly和γ-Glu-Cys-β-Ala能夠增加雞湯和牛肉湯的鮮味和濃厚味[14，15]。此外，采用滋味稀釋分析法和三選一實驗(three-alternative forced-choice)對γ-Glu-Ile在雞湯、牛肉湯和醬油中的厚味閾值進(jìn)行評價，見表1。γ-Glu-Ile在雞湯、牛肉湯和醬油中的厚味閾值分別為(0.62±0.20)，(0.83±0.37)，(0.91±0.29)mmol/L，結(jié)果與γ-Glu-Val、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Met等厚味閾值接近。

3 結(jié)論

解淀粉芽孢桿菌源谷氨酰胺酶可催化γ-Glu-Ile的合成，其最佳反應(yīng)條件為：最適底物濃度比Gln∶Ile為100∶200(mmol/L∶mmol/L)，最適pH值在9～10之間，最適溫度為37 ℃，反應(yīng)時間為10 h，最大產(chǎn)量為21.58 mmol/L。γ-Glu-Ile可以增加雞湯、牛肉湯和醬油的鮮味、厚味、酸味和甜味，且γ-Glu-Ile在雞湯、牛肉湯和醬油中的厚味閾值分別為(0.62±0.20)，(0.83±0.37)，(0.91±0.29) mmol/L。