楊玉霞，廖玲燕，楊紫霞，劉云芬，梁園麗，段振華，宋慕波，帥良，*

（1.賀州學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院，廣西賀州542899；2.北海職業(yè)學(xué)院，廣西北海536000）

馬蹄（water chestnut）又稱荸薺、尾梨、通天草等，屬莎草科多年生淺水草本植物，原產(chǎn)于印度，在我國主要分布于江西、廣西、江蘇、安徽、浙江、廣東等水澤地區(qū)，中國馬蹄產(chǎn)量占全世界95%以上，其中賀州馬蹄占中國產(chǎn)量的50%[1]。馬蹄皮薄肉嫩，水分充足，清甜無渣，爽脆可口，富含碳水化合物、多糖、各種維生素、胡蘿卜素、脂肪、蛋白質(zhì)、荸薺英、多酚類等營養(yǎng)物質(zhì)[2]。馬蹄可蔬可果，可糧可藥自古就有“地下雪梨”和“江南人參”的美譽(yù)，是加工功能保健食品的最佳原料之一[3]，馬蹄產(chǎn)品有馬蹄粉、馬蹄糕、馬蹄罐頭、馬蹄飲料、馬蹄果醋[4]等，在產(chǎn)品生產(chǎn)過程中產(chǎn)生了大量廢棄物馬蹄皮，馬蹄皮含有豐富黃酮類、多酚、甾醇類、色素[5]，也是回收再利用的重要材料；目前對(duì)馬蹄果酒研究很少，潘百明等[6]利用馬蹄皮發(fā)酵而成的果酒，酒精度達(dá)11%左右；韓明等[7]研制的馬蹄汁酒精飲品，酒精度較低。因此利用馬蹄全果發(fā)酵果酒既能提高果酒營養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)也解決馬蹄果皮資源浪費(fèi)的問題。

本文以馬蹄全果為原料，運(yùn)用酶解-發(fā)酵技術(shù)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解、發(fā)酵過程的工藝參數(shù)，旨在研制一款具有馬蹄風(fēng)味、口感怡人的特色果酒，為馬蹄產(chǎn)品開發(fā)及資源綜合利用提供理論參考。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

馬蹄：賀州泰興超市，挑選無病蟲害和無機(jī)械損傷的馬蹄；白砂糖：市售；乳酸（食品級(jí)）：河南金丹乳酸科技股份有限公司乳酸；淀粉酶（3 000 U/g）、纖維素酶（30 000 U/g）：湖南新鴻鷹生物有限公司；果酒酒曲：永州市雅大科技實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6）：國華電器有限公司；低速離心機(jī)（KDC-40）：安徽科大創(chuàng)新股份有限公司；原汁機(jī)（JYZ-E92）：九陽股份有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-1901PC）：上海奧析科學(xué)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（pH-070A）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（FE20）：梅特勒-托利多；數(shù)顯折光儀（LHB55）：杭州陸恒生物科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE311）：日本雅馬拓儀器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 工藝流程

2.1.1 馬蹄酶解液的制備流程

2.1.2 馬蹄果酒發(fā)酵工藝流程

2.2 操作要點(diǎn)

材料預(yù)處理：馬蹄洗凈切塊，放入清水中浸泡防止氧化，蒸汽預(yù)煮15 min軟化馬蹄，打漿備用。

酶解：馬蹄果漿裝入潔凈容器中，按比例加水調(diào)整濃度，用乳酸調(diào)整pH值，加入淀粉酶、纖維素酶，在適宜的溫度、pH值、時(shí)間下酶解。

成分調(diào)整：在酶解結(jié)束的馬蹄漿中，加入白砂糖、乳酸，將其調(diào)成合適的糖度、pH值，冷卻。

發(fā)酵：將酶解好的馬蹄漿倒入發(fā)酵瓶中，加入2/3為宜，添加果酒酒曲，密封發(fā)酵，發(fā)酵第1天間歇攪拌，當(dāng)發(fā)酵液面泡沫消失即發(fā)酵終點(diǎn)。

過濾、澄清：將發(fā)酵結(jié)束的酒醪用虹吸法過濾，靜置澄清2 d。

殺菌：將澄清的酒液于60℃～65℃的恒溫水浴鍋加熱20 min～25 min，取出迅速冷卻至26℃～28℃。

2.3 單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

酶解條件優(yōu)化：以馬蹄漿為原料接入淀粉酶和纖維素酶進(jìn)行酶解，以透光度、總糖含量作為酶解指標(biāo)，分別對(duì)淀粉酶用量（質(zhì)量比）、纖維素酶用量（質(zhì)量比）、料液比、酶解溫度和時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再根據(jù)各單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置L（934）酶解正交試驗(yàn)，研究各因素對(duì)馬蹄漿酶解過程的影響。正交因素水平見表1。

表1 酶解正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for enzymatic hydrolysis

酒精發(fā)酵條件優(yōu)化：以酶解后獲得的酶解液作為發(fā)酵原料，分別以果酒酒曲用量（質(zhì)量比）、初始糖度、發(fā)酵前pH值、溫度為因素考察其對(duì)馬蹄果酒發(fā)酵過程的影響，并設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，正交因素水平見表2。

2.4 分析方法

2.4.1 透光度的測定

取酶解樣液50 mL在4 000 r/min離心10 min，取上清液，用分光光度計(jì)在波長680 nm下測定透光度[8]。

2.4.2 總糖的測定

采用費(fèi)林試劑法測定[9]。取5 mL樣品水解液于100 mL的錐形瓶，并加入甲、乙液各5 mL，搖勻，加熱至沸騰狀態(tài)，用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至藍(lán)色消失，即為滴定終點(diǎn)。依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液所消耗體積，由公式可計(jì)算總糖含量。

式中：X為樣品總糖的含量，g/L；V0為空白試驗(yàn)消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V為樣品消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；c為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，g/mL；n為樣品稀釋倍數(shù)。

2.4.3 酒精度的測定

采用酒精計(jì)法[10]，用100mL容量瓶準(zhǔn)確量取100mL酒液于500 mL的蒸餾瓶中，再用100 mL蒸餾水分3次沖洗容量瓶，全部倒入蒸餾瓶中。緩慢蒸餾至接近100 mL，取下，放在20℃水浴保溫30 min，將餾出液倒入100 mL量筒中，放入潔凈的酒精計(jì)，待其平衡后，水平讀取與月牙面相切處的刻度值，即為酒精度，單位為%。

2.4.4 糖度的測定

用數(shù)顯折光儀測定。

2.4.5 pH值測定

用pH計(jì)測定。

2.4.6 感官評(píng)價(jià)測定

請10位老師同學(xué)按香氣、滋味、顏色、風(fēng)格4個(gè)方面對(duì)馬蹄果酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)（滿分為100分）[11-12]，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 馬蹄果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation standard of water chestnut fruit wine

3 結(jié)果分析

3.1 酶解工藝的確定

3.1.1 淀粉酶的確定

以料液比為1∶3（g/mL）制成馬蹄漿，纖維素酶添加量0.02%，酶解溫度70℃，pH值為6.0，酶解時(shí)間60 min，淀粉酶添加量分別以0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%進(jìn)行酶解，比較不同淀粉酶添加量對(duì)透光度和總糖含量的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 淀粉酶用量對(duì)馬蹄酶解的影響Fig.1 Effects of amylase addition on water chestnut enzymatic hydrolysis

由圖1可知，添加淀粉酶能明顯提高馬蹄漿的透光度和總糖含量，隨著淀粉酶添加量的增加，透光度和總糖含量也逐漸變大，當(dāng)?shù)矸勖柑砑恿窟_(dá)0.3%，透光度為77.89%，總糖含量達(dá)23.01 g/L；之后繼續(xù)增加淀粉酶用量，透光度值沒有明顯變化，總糖含量也趨于平穩(wěn)甚至出現(xiàn)降低的現(xiàn)象。由于底物被消耗完，酶解反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)，酶分子的競爭導(dǎo)致此現(xiàn)象發(fā)生。這說明適量的淀粉酶有助于提高馬蹄漿的透光度和總糖含量；淀粉酶過量時(shí)，效果不會(huì)出現(xiàn)較大的提升，甚至?xí)蟹醋饔谩Ｓ纱丝芍?，在馬蹄漿酶解過程中淀粉酶的添加量0.3%為宜。

3.1.2 纖維素酶的確定

以料液比為1∶3（g/mL）制成馬蹄漿，淀粉酶添加量0.2%，溫度70℃，pH 6.0，分別加入0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%纖維素酶，酶解時(shí)間60 min，比較不同纖維素酶添加量對(duì)透光度和總糖含量的影響，結(jié)果見圖2。

馬蹄皮中含有豐富的纖維素，纖維素酶能將纖維素降解為葡萄糖。由圖2可知，纖維素的用量對(duì)馬蹄漿的品質(zhì)影響較大，當(dāng)纖維素酶的添加量在0%～0.02%之間時(shí)，馬蹄漿酶解液的透光度和總糖含量不斷增加，透光度從59.43%上升至82.04%，總糖含量從19.23 g/L上升至23.16 g/L；然而當(dāng)添加量超過0.02%之后，透光度變化不明顯，總糖含量趨于平穩(wěn)甚至降低。考慮到效果與成本問題，纖維素酶的最佳用量選擇0.02%。

圖2 纖維素酶用量對(duì)馬蹄酶解的影響Fig.2 Effects of cellulose addition on water chestnut enzymatic hydrolysis

3.1.3 酶解溫度的確定

以料液比1∶3（g/mL）制成馬蹄漿，纖維素酶添加量為0.02%，淀粉酶添加量為0.2%，pH 6.0，溫度分別為 60、65、70、75、80℃的條件下酶解 60 min，比較不同溫度對(duì)馬蹄漿酶解液透光度和總糖含量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對(duì)馬蹄漿酶解的影響Fig.3 Effects of temperature on Water chestnut enzymatic hydrolysis

溫度對(duì)酶活性有很大影響，從而影響酶促反應(yīng)。由圖3可知，溫度從60℃到70℃時(shí)，透光度呈逐漸增大的趨勢，其中溫度為70℃時(shí)，透光度達(dá)最大值68.09%，而超過70℃以后，透光度快速下降直至不變。然而，溫度為超過70℃之后，總糖含量是呈下降趨勢。這說明合適的溫度范圍內(nèi)，酶解隨著溫度升高，酶活性增強(qiáng)，但超過適宜溫度，不宜酶與底物反應(yīng)，甚至使酶失活[13]。因此，初步確定酶解溫度為65℃。

3.1.4 酶解時(shí)間的確定

以料液比為1∶3（g/mL），纖維素酶添加量0.02%，淀粉酶添加量0.2%，酶解溫度70℃，pH6.0為條件，酶解時(shí)間分別為 30、60、90、120、150 min 進(jìn)行試驗(yàn)，比較不同酶解時(shí)間對(duì)透光度和總糖含量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 時(shí)間對(duì)馬蹄酶解的影響Fig.4 Effects of time on water chestnut enzymatic hydrolysis

酶解時(shí)間的長短，決定著酶解的充分程度，是酶解的關(guān)鍵因素之一。由圖4可知，反應(yīng)時(shí)間在30 min～90 min時(shí)，總糖含量不斷增加，超過90 min以后，總糖量逐漸減?。蝗欢?dāng)酶解時(shí)間大于60 min以后，透光率開始不斷下降。這說明了酶解時(shí)間與反應(yīng)密切相關(guān)，時(shí)間過短，酶解反應(yīng)不充分；時(shí)間過長，對(duì)酶解液的澄清度有較大影響[14]。所以，綜合考慮，初步確定酶解時(shí)間為60 min。

3.1.5 酶解pH值的確定

料液比為1∶3（g/mL）制成馬蹄漿，纖維素酶添加量0.02%，淀粉酶添加量0.2%，溫度70℃，pH值分別調(diào)整為 5.5、6.0、6.5、7.0，酶解 60 min，比較不同 pH 值對(duì)透光度和總糖含量的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 pH值對(duì)馬蹄酶解的影響Fig.5 Effects of pH on water chestnut enzymatic hydrolysis

由圖5可知，當(dāng)pH 6.0時(shí)，透光度和總糖含量均達(dá)最高，分別為 78.42%，22.64 g/L；當(dāng) pH＞6.0之后，透光度大小和總糖含量都開始出現(xiàn)下降，原因是不同pH值環(huán)境影響酶的活性。因此，酶解pH值定為6.0，而且不用于正交試驗(yàn)的考慮因素。

3.1.6 料液比的確定

料液比分別為 1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5（g/mL），在淀粉酶添加量0.2%，纖維素酶添加量為0.02%，溫度為70℃，pH6.0的條件下酶解60 min，比較不同料液比對(duì)透光度和總糖含量的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 料液比對(duì)馬蹄漿酶解的影響Fig.6 Effects of solid-liquid ratio on water chestnut enzymatic hydrolysis

不同料液比對(duì)酶解底物的溶度有很大影響，底物濃度與酶解關(guān)系密切，濃度過大或過小都會(huì)影響酶分子與底物的接觸面積，從而影響酶解反應(yīng)是否充分[15]。由圖 6 可知，在料液比 1 ∶1（g/mL）到 1 ∶3（g/mL）之間，透光度不斷升高；料液比1∶3（g/mL）之后，開始降低；當(dāng)料液比為1∶3（g/mL）時(shí)，酶解效果最好，考慮到濃度過稠或過稀可能會(huì)影響發(fā)酵的品質(zhì)，因此，最佳酶解的料液比選擇1∶3（g/mL），且不作為正交試驗(yàn)的參考因素。

3.1.7 酶解正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)各單因素試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮選擇淀粉酶的用量、纖維素酶的用量、溫度、時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)，酶解正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 L9（34）酶解正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4The result and analysis of L9（34）orthogonal experiment for enzymatic hydrolysis

續(xù)表4 L9（34）酶解正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Continue table 4The result and analysis of L9（34）orthogonal experiment for enzymatic hydrolysis

由表4中的方差分析可以知道，各因素對(duì)酶解的影響程度為：D＞A＞C＞B，即時(shí)間＞淀粉酶用量＞溫度＞纖維素用量，最佳酶解條件為D1A3C1B1，酶解時(shí)間30 min，淀粉酶添加量為0.4%，酶解溫度為60℃，纖維素用量0.015%。

3.1.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)中透光度最高的組合D1A3B3C2與正交試驗(yàn)極差分析中得到的最優(yōu)組合D1A3B1C1進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。經(jīng)D1A3B1C1處理的馬蹄漿總糖含量27.04 g/L，透光度89.16%，上清液澄清透亮，馬蹄香氣怡人。經(jīng)D1A3B3C2處理的總糖含量較低，25.30g/L，透光度85.2%，馬蹄香不足。因此，酶解工藝最優(yōu)組合為D1A3B1C1，即酶解時(shí)間30 min，淀粉酶接入量0.4%，酶解溫度60℃，纖維素用量0.015%。

3.2 發(fā)酵工藝參數(shù)的確定

3.2.1 果酒酒曲用量的確定

經(jīng)酶解處理的馬蹄漿用白砂糖將初始糖度調(diào)為22%，發(fā)酵初pH值為5.5，分別加入果酒酒曲0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%于28℃恒溫箱內(nèi)發(fā)酵，7 d后，酒液面泡沫基本消失，即為發(fā)酵終點(diǎn)，結(jié)果見表5。

表5 果酒酒曲用量對(duì)果酒的影響Table 5 Effects of Wine could on fruit wine

隨著果酒酒曲的增加，酒精度逐漸上升；酒曲加入量過大時(shí)，發(fā)酵劇烈，雖然產(chǎn)酒精能力強(qiáng)，但糖分消耗快，有輕微的異味，口感不協(xié)調(diào)；酒曲加入量過小時(shí)，發(fā)酵速度緩慢，酒精度低，醇香不足，口感平淡，澄清度不夠[16-17]。所以，酒曲用量為0.5%比較合適。

3.2.2 發(fā)酵初始糖度的確定

經(jīng)酶解處理的馬蹄漿用白砂糖將初始糖度分別調(diào)為18%、20%、22%、24%、26%，酒曲添加量為0.5%，發(fā)酵初始pH 5.5，在28℃恒溫箱中發(fā)酵7 d，結(jié)果見表6。

表6 發(fā)酵初始糖度對(duì)果酒的影響Table 6 Effects of sugar content on fruit wine

發(fā)酵時(shí)，酒曲利用糖分進(jìn)行生長繁殖，并產(chǎn)出酒精、酯類等物質(zhì)，當(dāng)糖度合適時(shí)酵母繁殖和代謝速度都比較快[18]，但當(dāng)糖度過高時(shí)，樣品滲透壓加大，會(huì)抑制酵母菌的生長繁殖，導(dǎo)致酒精度下降[19-20]，同時(shí)，高糖度也會(huì)促進(jìn)高級(jí)醇、琥珀酸等副產(chǎn)物的生成，導(dǎo)致果酒口味苦澀刺喉，感官品質(zhì)下降[21]；當(dāng)糖度過低時(shí)，發(fā)酵不充分，酒精度低，甜度不足，口感不協(xié)調(diào)。綜上所述，初始糖度22%最佳。

3.2.3 發(fā)酵溫度的確定

經(jīng)酶解處理的馬蹄漿用白砂糖將初始糖度調(diào)為22%，發(fā)酵初始pH5.5，加入果酒酒曲0.5%，分別在24、26、28、30、32 ℃的條件下發(fā)酵 7 d，結(jié)果見表 7。

表7 發(fā)酵溫度對(duì)果酒的影響Table 7 Effects of fermenting temperature on fruit wine

隨著溫度的升高，酒精度也逐漸升高，原因是低溫時(shí)酒曲的生長受到抑制，使得糖的轉(zhuǎn)化率小，發(fā)酵不徹底，酒精度偏低風(fēng)味平淡[7]，溫度過高時(shí)，雖然酒精度高，但是感官評(píng)價(jià)低，由于過高的溫度不利于酒液中的香氣保存，不易控制雜菌的生長繁殖，使得酒體澄清度不夠，有異味。所以最佳發(fā)酵溫度是28℃。

3.2.4 發(fā)酵前pH值的確定

經(jīng)酶解處理的馬蹄漿用白砂糖將初始糖度調(diào)為22%，加入果酒酒曲0.5%，分別在調(diào)整pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，在 28 ℃下發(fā)酵 7 d，結(jié)果見表 8。

表8 發(fā)酵pH值對(duì)果酒的影響Table 8 Effects of pH on fruit wine

由表8可知，當(dāng)pH 6.0時(shí)，酒精度和感官評(píng)價(jià)都是最高。pH值較低時(shí)，酒精度偏低，酒體不夠澄清，香氣不足。所以，最佳pH值為6.0。

3.2.5 發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果分析

發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果見表9。

表9 L9（34）發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 9The result and analysis of L9（34）orthogonal experiment for fermentation

由表9方差分析可知，影響馬蹄果酒品質(zhì)的主次因素是C＞A＞B＞D，即時(shí)間＞淀粉酶用量＞溫度＞纖維素用量；最佳發(fā)酵組合是C2A3B3D2，即發(fā)酵溫度30℃，果酒酒曲用量0.5%，初始糖度24%，pH6.0。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，馬蹄果酒感官評(píng)價(jià)為92分，比正交試驗(yàn)感官評(píng)價(jià)最高組合C2A3B3D1評(píng)分高。酒精度為12%，酒液顏色淡黃，澄清透亮，酒香與馬蹄香協(xié)調(diào)，口感純正。

4 結(jié)論

本研究確定了馬蹄酶解工藝條件，在單因素條件基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果顯示各因素對(duì)酶解的影響程度為：時(shí)間＞淀粉酶用量＞溫度＞纖維素用量，馬蹄酶解的最優(yōu)條件為酶解時(shí)間30 min，淀粉酶添加量為0.4%，酶解溫度為60℃，纖維素用量0.015%。在最優(yōu)的酶解條件下進(jìn)行酒精發(fā)酵工藝研究，結(jié)果表明，馬蹄果酒發(fā)酵最優(yōu)條件是發(fā)酵溫度30℃，果酒酒曲用量0.5%，初始糖度24%，pH值為6.0。在此條件下發(fā)酵的馬蹄果酒，顏色為淺黃色，清澈透亮且有光澤，酒香濃郁伴有馬蹄清香，酸甜適中，口感純正。本研究有一定的實(shí)用價(jià)值，可為特色營養(yǎng)馬蹄風(fēng)味果酒的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。