郭映雪 孫墨瓏

摘 要：為探討核桃楸外果皮三萜類(lèi)物質(zhì)提取方法的響應(yīng)面優(yōu)化，研究其抑菌活性，本文采用超聲輔助的乙醇溶劑提取法提取核桃楸外果皮三萜類(lèi)物質(zhì)，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合法設(shè)計(jì)多因素試驗(yàn)，分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和液料比對(duì)三萜類(lèi)物質(zhì)提取率的影響，確定最佳提取條件。此外，進(jìn)一步研究三萜類(lèi)物質(zhì)對(duì)黃孢原毛平革菌（白腐真菌）和綠色木霉菌的抑菌活性。結(jié)果表明：核桃楸外果皮三萜類(lèi)物質(zhì)的最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、超聲時(shí)間為44 min、液料比為19∶1（mL/g），此時(shí)核桃楸外果皮三萜類(lèi)物質(zhì)的提取率為2.62 mg/g。抑菌實(shí)驗(yàn)表明，核桃楸外果皮三萜類(lèi)物質(zhì)對(duì)黃孢原毛平革菌（白腐真菌）和綠色木霉菌均具有抑菌效果，最大抑菌圈直徑分別達(dá)到18.43 mm和18.92 mm。本研究表明核桃楸外果皮三萜類(lèi)提取物具有良好的抑菌活性，為核桃楸外果皮的開(kāi)發(fā)和研究提供參考。

關(guān)鍵詞：核桃楸;三萜類(lèi)物質(zhì);超聲提取;響應(yīng)面;抑菌活性

Abstract：To optimize the extraction method of triterpenoids from the green peel of Juglans mandshurica Maxim by response surface， and to study its antibacterial activity， ultrasound-assisted ethanol extraction was used to extract the triterpenoids from the green peel of Juglans mandshurica， and the extraction process was optimized by response surface methodology （RSM）. On the basis of single factor experiment， the optimal extraction conditions were explored through Box-Behnken central composite design， studying the effects of ethanol volume fraction， ultrasonic time and liquid-to-material ratio on the extraction rate of triterpenoids. In addition， the antibacterial activities of triterpenoids against Phanerochaete chrysosporium Burdsall and Trichoderma viride were further studied. The results showed that the optimal extraction conditions of triterpenoids from the green peel of Juglans mandshurica were： ethanol volume fraction 80%， ultrasonic time 44 min， liquid to material ratio 19∶1， and extraction rate was 2.62 mg/g. The bacteriostasis test showed that the triterpenoids of the green peel of Juglans mandshurica had antibacterial activities against Phanerochaete chrysosporium Burdsall and Trichoderma viride， the maximum inhibition zone diameter was 18.43 mm and 18.92 mm respectively. This study showed triterpenoids in the green peel of Juglans mandshurica had good bacteriostatic activity and provided a reference for the development and research of the green peel of Juglans mandshurica.

Keywords：Juglans mandshurica Maxim; triterpenoid; ultrasonic extraction; response surface; antibacterial activity

0 引言

核桃楸（Juglans mandshurica Maxim）是胡桃科、胡桃屬植物，落葉喬木，主要分布于我國(guó)東北、華北和河北等地區(qū)，是東北三大硬闊樹(shù)種之一，是一種前景廣闊的木本油料植物。核桃楸是我國(guó)十分重要的藥源植物，其樹(shù)皮、樹(shù)葉及成熟的果實(shí)與果皮均可入藥，均有顯著的抗菌、消炎、抗氧化以及抗癌等作用[1-3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，核桃楸的不同部位均具有一定的藥用價(jià)值，核桃楸外果皮的主要化學(xué)成分包括黃酮類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)、生物堿、萜類(lèi)及強(qiáng)心苷等活性物質(zhì)[4-7]。萜類(lèi)是三大次生代謝產(chǎn)物之一，在自然界分布廣泛，尤其存在中國(guó)的傳統(tǒng)天然藥物中，具有廣泛的藥理作用和重要的生物活性[8-10]。萜類(lèi)物質(zhì)是指具有（C5H8）n通式以及其含氧和不同飽和程度的衍生物，可以看成是由異戊二烯或異戊烷以各種方式連結(jié)而成的一類(lèi)天然化合物，可分為單萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜及多萜化合物等[11]。其中三萜類(lèi)化合物作為一類(lèi)重要的天然化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)血糖、降血壓和抗腫瘤等作用[12]。相關(guān)人員對(duì)核桃楸的研究主要集中對(duì)黃酮類(lèi)、醌類(lèi)、酚類(lèi)、揮發(fā)油和多糖類(lèi)等化學(xué)成分及其生物活性的研究，有關(guān)核桃楸外果皮的三萜類(lèi)物質(zhì)提取和應(yīng)用尚鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以熊果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用超聲輔助的乙醇溶劑提取法提取核桃楸外果皮三萜類(lèi)物質(zhì)，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并探討核桃楸外果皮三萜類(lèi)物質(zhì)對(duì)黃孢原毛平革菌（白腐真菌）和綠色木霉菌的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

材料：核桃楸外果皮，采于2017年?yáng)|北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng);黃孢原毛平革菌（白腐真菌）（Phanerochaete chrysosporium）和綠色木霉菌（Trichoderma viride）均由東北林業(yè)大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。試劑：熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)級(jí)純（阿拉丁試劑）;乙醇、冰乙酸、香草醛和高氯酸均為分析純。儀器：RE-2000 A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，KQ 3200 DE型數(shù)控超聲波清洗器，TU-1901型紫外分光光度計(jì)，800型電動(dòng)離心機(jī)，BS-224-S電子天平，DHG 9145 A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

稱(chēng)量5 g核桃楸外果皮粗粉，溶于乙醇溶液里超聲提取，抽濾離心后得到乙醇粗提溶液。將其減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，加入水、氯仿和甲醇各100 mL，體積比為1∶1∶1，進(jìn)行萃取，分離留下氯仿液。將其減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，加入50 mL無(wú)水甲醇溶液，得到三萜類(lèi)物質(zhì)提取液。

1.2.1 單因素法探究提取條件

采用單因素法，分別探究乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和液料比對(duì)三萜類(lèi)物質(zhì)提取率的影響，得到各因素最佳提取條件?？刂瞥晻r(shí)間40 min和液料比15∶1不變，比較不同乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90%條件下三萜類(lèi)物質(zhì)的提取率;控制乙醇體積分?jǐn)?shù)80%和液料比15∶1不變，比較不同超聲時(shí)間20、30、40、50、60 min下三萜類(lèi)物質(zhì)的提取率;控制乙醇體積分?jǐn)?shù)80%和超聲時(shí)間40 min不變，比較不同液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1條件下三萜類(lèi)物質(zhì)的提取率[13]。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-Expert軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理選取影響三萜類(lèi)物質(zhì)提取的3個(gè)因素：乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和液料比進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化組合[14]，表1為因素水平設(shè)計(jì)表。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線(xiàn)的繪制

精密稱(chēng)取10 mg熊果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，溶于無(wú)水甲醇中，定容至50 mL，搖勻制成濃度為0.2 mg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別置于試管中，水浴蒸干，滴加0.4 mL的5 %香草醛醋酸溶液和1.6 mL高氯酸溶液，在65 ℃水浴加熱15 min，取出冷凝水沖涼至室溫，加5 mL冰醋酸搖勻后靜置，在最大吸收峰548 nm處測(cè)定吸光度[13]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到回歸方程為：

A = 36.573c + 0.378。

式中：A為吸光度;c為標(biāo)準(zhǔn)品熊果酸的濃度，mg/mL。決定系數(shù)R2 = 0.999。

1.3.2 三萜類(lèi)物質(zhì)的含量測(cè)定

精確抽取1 mL甲醇溶液于試管中，進(jìn)行上述標(biāo)準(zhǔn)品的定性鑒定，在最大吸收峰548 nm處測(cè)定吸光度A，將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程中，即可得到三萜類(lèi)物質(zhì)含量。

1.3.3 三萜類(lèi)物質(zhì)的抑菌實(shí)驗(yàn)

將已高溫滅菌的PDA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中冷卻凝固，用接種針取適量白腐真菌或綠色木霉菌放入盛有玻璃珠和蒸餾水的試管中，劇烈震蕩試管打散菌絲。取棉簽輕輕蘸取試管中的白腐真菌或綠色木霉菌菌液10～20次均勻涂在培養(yǎng)基上，待用。將核桃楸外果皮三萜類(lèi)提取原液用無(wú)水甲醇稀釋至濃度分別為44、22、11、5.5 μg/mL的一系列三萜類(lèi)提取液，及空白對(duì)照樣無(wú)水甲醇。用打孔器依次在培養(yǎng)基上打出5個(gè)孔，將溶液按照濃度打入孔中，平行3次。置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀(guān)察生長(zhǎng)情況，通過(guò)十字交叉法用游標(biāo)卡尺測(cè)量孔內(nèi)徑，記錄抑菌圈直徑，比較抑菌作用的大小，計(jì)算抑菌效率[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。由圖1（a）可以看出，三萜類(lèi)物質(zhì)提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí)，提取率達(dá)到最大值。此時(shí)繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取率反而下降，因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)過(guò)高，溶劑的極性降低，一些醇溶性雜質(zhì)和極性比較小的成分溶出，阻礙目標(biāo)活性成分的溶出，導(dǎo)致提取率下降。

由圖1（b）可以看出，三萜類(lèi)物質(zhì)提取率隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間為40 min時(shí)，提取率達(dá)到最大值。原因是延長(zhǎng)超聲時(shí)間，提取液的溫度上升，使三萜類(lèi)物質(zhì)的溶出量增多;但當(dāng)超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，提取液的溫度過(guò)高，導(dǎo)致部分三萜類(lèi)物質(zhì)被分解，結(jié)構(gòu)被破壞，從而使提取率下降。

由圖1（c）可以看出，三萜類(lèi)物質(zhì)提取率隨料液比的增大呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢(shì)，當(dāng)液料比為15∶1時(shí)，提取率達(dá)到最大值。主要是由于提取溶劑用量的增加提高了核桃楸外果皮原料與溶劑間三萜類(lèi)物質(zhì)的濃度差，有利于其從原料向溶劑中擴(kuò)散，提高提取率;當(dāng)大部分活性物質(zhì)已經(jīng)滲出時(shí)，再增加液料比，提取率反而下降，可能是需要蒸發(fā)濃縮的時(shí)間更久，三萜類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，考慮成本，選擇15∶1 mL/g[17]。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析與優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)模型的建立

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)提取核桃楸外果皮三萜類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化組合，表2為優(yōu)化響應(yīng)面方案設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果。

2.2.2 回歸方程與方差分析

通過(guò)Design Expert對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)回歸擬合分析，建立提取率（Y）與乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲時(shí)間（B）、液料比（C）的線(xiàn)性回歸方程：

回歸模型的方差分析顯示，P<0.000 1，說(shuō)明該模型具有顯著性，且差異極顯著（P<0.01）。決定系數(shù)R2=0.975 7，修訂系數(shù)R2Adj=0.944 5，說(shuō)明該模型擬合度較好，試驗(yàn)誤差小[18]。信噪比為13.895>4，說(shuō)明該模型響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)，回歸方程擬合度好，可進(jìn)行真實(shí)值的分析和預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。變異系數(shù)（C.V）=8.23，說(shuō)明該模型可重復(fù)。一次項(xiàng)C和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)三萜類(lèi)物質(zhì)提取率的影響是極顯著的;一次項(xiàng)A、B對(duì)三萜類(lèi)物質(zhì)提取率的影響是顯著的;交互項(xiàng)AC交互影響存在顯著關(guān)系，其他交互影響均不存在顯著性差異。三因素對(duì)三萜類(lèi)物質(zhì)提取率的影響大小順序?yàn)椋阂毫媳龋–）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲時(shí)間（B）。

2.2.3 等值線(xiàn)圖和響應(yīng)面圖分析

利用Design Expert對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和液料比選取一個(gè)因素固定，其他兩因素及其交互作用對(duì)三萜類(lèi)物質(zhì)提取率的等值線(xiàn)圖和響應(yīng)面圖如圖2所示。

模型中A、B、C，其中兩個(gè)因素固定在0水平，得到另外一個(gè)因素對(duì)三萜類(lèi)物質(zhì)提取率的子模型。由圖2可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）和超聲時(shí)間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）和液料比（C）、超聲時(shí)間（B）和液料比（C）對(duì)三萜類(lèi)提取率的交互作用。響應(yīng)面坡陡峭程度和等高線(xiàn)形狀反映出交互作用的強(qiáng)度，如果響應(yīng)面坡度相對(duì)平緩，則說(shuō)明受提取因素變化的影響不大;相反，如果坡度比較陡峭，則說(shuō)明響應(yīng)面值受提取因素變化的影響較大。若等高線(xiàn)呈橢圓形，表明兩兩因素相互效應(yīng)明顯，呈圓形則反之[19]。圖2中3個(gè)響應(yīng)面圖均為平滑的曲面，且開(kāi)口向下，說(shuō)明最大響應(yīng)值就存在于曲面上，且在所設(shè)計(jì)的因素水平范圍內(nèi)能夠找到最佳工藝條件。

由Design Expert軟件進(jìn)一步對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行最優(yōu)化分析，得到提取的最佳工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為82.48%、超聲時(shí)間為44.45 min、液料比為19.42∶1 mL/g，預(yù)測(cè)值為2.67 mg/g?？紤]到試驗(yàn)的可操作性，將修正為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、超聲時(shí)間為44 min、液料比為19∶1 mL/g，重復(fù)三次驗(yàn)證試驗(yàn)。按上述修正后的條件進(jìn)行提取，得到三萜類(lèi)物質(zhì)的平均提取率為2.62 mg/g，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.87%，說(shuō)明模型可靠，提取效果理想。王占一等[13]從石榴皮中超聲波輔助提取三萜類(lèi)化合物，并通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化工藝條件，提取率大大提升為0.563%。本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助的乙醇溶劑提取法提取核桃楸外果皮三萜類(lèi)物質(zhì)，在單因素實(shí)驗(yàn)確定每個(gè)影響因素的最佳值后，利用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化其提取工藝條件，提取結(jié)果與響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)值相差不大，驗(yàn)證了提取工藝可行。

2.3 三萜類(lèi)物質(zhì)抑菌效果分析

用外果皮三萜類(lèi)物質(zhì)提取液處理后，觀(guān)察到白腐真菌和綠色木霉菌均從第4天開(kāi)始生長(zhǎng)（圖3），其中1、2、3、4分別代表濃度為44、22、11、5.5 μg/mL的三萜類(lèi)提取液，5代表空白對(duì)照。之后每天測(cè)量產(chǎn)生抑菌圈直徑的大小，其直徑變化情況如圖4和圖5所示。

核桃楸外果皮三萜類(lèi)物質(zhì)提取液的抑菌活性實(shí)驗(yàn)證明，其對(duì)白腐真菌和綠色木霉菌均有較明顯的抑菌活性。由圖4可知，在白腐真菌生長(zhǎng)的4～9 d中，

同理，由圖5可知，只有5.5 μg/mL的三萜類(lèi)物質(zhì)提取液幾乎和空白對(duì)照樣的抑菌圈直徑相同，其他濃度提取液的抑菌性遠(yuǎn)比空白樣強(qiáng)，并且抑菌效果與提取液濃度有關(guān)。在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，抑菌性與萜類(lèi)提取物濃度呈正相關(guān)。其中44 μg/mL的三萜類(lèi)物質(zhì)提取液最大抑菌圈直徑為18.92 mm，最小抑菌圈直徑為12.61 mm，間隔時(shí)間為5 d，其抑菌效率為1.26 mm/d。

三萜類(lèi)物質(zhì)具有較強(qiáng)的抑菌性。劉高強(qiáng)等[20]檢測(cè)出赤芝菌體三萜化合物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)均具有顯著抑制作用。本實(shí)驗(yàn)中三萜類(lèi)物質(zhì)提取液對(duì)白腐真菌和綠色木霉菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑隨著時(shí)間先下降后趨于穩(wěn)定，其中在前3 d下降最快，抑菌效果最佳?？赡苁怯捎谂囵B(yǎng)的菌種進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)速率較快，抑菌圈直徑變化較大[21]。推測(cè)三萜類(lèi)物質(zhì)具有抑菌性的原因?yàn)槠淇梢云茐木N結(jié)構(gòu)，擾亂菌種生長(zhǎng)周期，抑制目標(biāo)菌細(xì)胞內(nèi)的糖類(lèi)及代謝中間產(chǎn)物的氧化脫氫過(guò)程，同時(shí)降低細(xì)胞內(nèi)酶的活性，甚至是直接抑制細(xì)胞內(nèi)核酸分子合成，從而達(dá)到使細(xì)胞凋亡，進(jìn)而達(dá)到殺滅細(xì)菌的目的[22]。三萜類(lèi)物質(zhì)提取液對(duì)白腐真菌和綠色木霉菌的抑菌效果與提取液濃度成正比，濃度越大，抑菌效果越好，具有較好的抑菌活性。由此可見(jiàn)，核桃楸外果皮具有良好的生物活性，可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)其更多的綜合利用價(jià)值。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用超聲輔助的乙醇溶劑提取法提取核桃楸外果皮三萜類(lèi)物質(zhì)，利用響應(yīng)面法在三因素三水平的設(shè)計(jì)下，優(yōu)化提取工藝條件，得到各因素的主要影響關(guān)系由大到小順序?yàn)椋阂毫媳取⒁掖俭w積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間。最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、超聲時(shí)間為44 min、液料比為19∶1，最大提取率可達(dá)到2.62 mg/g。與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值2.67 mg/g的相對(duì)誤差為1.87%，說(shuō)明模型可靠，提取效果理想。核桃楸外果皮三萜類(lèi)物質(zhì)對(duì)黃孢原毛平革菌（白腐真菌）和綠色木霉菌均具有一定的抑菌效果，最大抑菌圈直徑分別達(dá)到18.43 mm和18.92 mm，但受提取液濃度影響較大，提取液濃度越小，抑菌效果越不明顯。

我國(guó)核桃楸資源豐富，關(guān)于三萜類(lèi)活性物質(zhì)的研究報(bào)道較少。本文說(shuō)明核桃楸外果皮三萜類(lèi)物質(zhì)的提取工藝切實(shí)可行，并具有一定的抑菌作用，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

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