尹曉蛟，何銀生，王智，吳德智，周武先，楊旭*

(1.湖北生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430200； 2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 中藥材研究所，湖北 恩施 445000;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

重樓屬是百合科植物中藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值最為重要的一個(gè)屬，在我國(guó)具有悠久的藥用歷史，其主要藥用部位是根狀莖，有清熱解毒、消腫止痛等功效，為云南白藥、宮血寧、奪命丹等經(jīng)典中成藥的主要原料。重樓作為珍貴藥材表現(xiàn)出的可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值驅(qū)使人們掠奪式采挖，導(dǎo)致野生重樓種群數(shù)量越來(lái)越少，唯有通過(guò)人工栽植才能保證資源可持續(xù)利用。重樓種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展的同時(shí)也對(duì)良種選育提出了更高的要求。一直以來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者更偏重重樓的藥理活性、化學(xué)成分分析、快繁和人工栽培技術(shù)分析，重樓種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究成果則相對(duì)較少。近年來(lái)，重樓遺傳多樣性分析主要采用分子標(biāo)記手段進(jìn)行基因水平研究[1-5]，作為遺傳多樣性表現(xiàn)形式之一的表型性狀多樣性分析在重樓中卻鮮見(jiàn)報(bào)道。

鑒于此，本研究以13種重樓屬植物為材料，通過(guò)對(duì)其18個(gè)表型性狀指標(biāo)的數(shù)量分析，了解供試重樓種質(zhì)的表型變異程度，基于表型性狀數(shù)據(jù)對(duì)各種質(zhì)進(jìn)行聚類(lèi)分析以揭示它們的親緣關(guān)系，并采用主成分分析方法和相關(guān)性分析方法分析與重樓產(chǎn)量關(guān)系密切的主要表型特征，以期為重樓種質(zhì)的遺傳改良和新品種選育提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的重樓種質(zhì)材料共13份，編號(hào)如下：1，毛重樓；2，多葉重樓；3，球藥隔重樓；4，短瓣球藥隔重樓；5，黑籽重樓；6，矮重樓；7，金線(xiàn)重樓；8，亮葉重樓；9，啟良重樓；10，狹葉重樓；11，華重樓；12，長(zhǎng)藥隔重樓；13，凌云重樓。2019年5月采自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所的重樓種質(zhì)資源圃。

1.2 性狀測(cè)定

選擇具有代表性、遺傳相對(duì)穩(wěn)定、易于獲得和測(cè)定的18個(gè)表型性狀，包括株高、根莖長(zhǎng)、根莖粗、根莖干質(zhì)量、基莖粗、葉片數(shù)、花梗長(zhǎng)、花瓣長(zhǎng)、雄蕊長(zhǎng)、雄蕊數(shù)、花柱裂、葉片長(zhǎng)、葉片寬、葉柄長(zhǎng)、萼片數(shù)、萼片長(zhǎng)、萼片寬、總?cè)~面積。用卷尺測(cè)量株高、根莖長(zhǎng)、花梗長(zhǎng)、花瓣長(zhǎng)、雄蕊長(zhǎng)、葉片長(zhǎng)、葉片寬、葉柄長(zhǎng)、萼片長(zhǎng)、萼片寬，精確到0.1 cm。用游標(biāo)卡尺測(cè)量根莖直徑、基莖直徑，精確到0.01 cm。其中，根莖直徑為根狀莖最粗處的直徑，基莖直徑為直立莖基部的直徑。根莖干質(zhì)量用電子天平稱(chēng)量，精確到0.01 g?？?cè)~面積用葉片形態(tài)測(cè)量?jī)x測(cè)量。

利用Shannon-weaver多樣性指數(shù)(H′)評(píng)價(jià)表型遺傳多樣性，計(jì)算公式：

H′=-∑PilnPi。

式中，Pi為某性狀第i級(jí)別材料份數(shù)占材料總數(shù)的百分比，其中數(shù)值性狀的分級(jí)按照第1級(jí)[Xi<(X-2δ)]到第10級(jí)[Xi>(X+2δ)]，每0.5δ為1級(jí)。

供試重樓表型性狀遺傳多樣性的聚類(lèi)分析借助NTsys-pc 2.1軟件完成，在聚類(lèi)分析前對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，通過(guò)軟件計(jì)算各材料間的卡方距離，并按非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法(unweighted pair group method using arithmetic average, UPGMA)對(duì)不同重樓種質(zhì)資源材料進(jìn)行聚類(lèi)，生成樹(shù)狀聚類(lèi)譜系圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2003軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)值性狀的平均值、最大值、最小值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)。用SPSS 22.0軟件對(duì)表型性狀做相關(guān)性分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多樣性

重樓各數(shù)量性狀的變異情況見(jiàn)表1，各表型性狀的變異系數(shù)差異較大。葉柄長(zhǎng)度的變異系數(shù)最高，達(dá)到87.10%，說(shuō)明種質(zhì)間葉柄長(zhǎng)度差異大，離散程度高。變異系數(shù)最低的是根莖直徑，為12.01%，表明各種質(zhì)的根莖直徑穩(wěn)定性較好。

表1 重樓屬種質(zhì)表型性狀遺傳變異分析

注：**表示差異達(dá)到1%顯著水平，*表示差異達(dá)到5%顯著水平。

供試種質(zhì)性狀的Shannon-Weaver多樣性指數(shù)為1.88～2.66，變幅較大，平均2.30；除花瓣長(zhǎng)、根莖直徑和根莖干質(zhì)量3個(gè)性狀外，其余15個(gè)測(cè)量性狀多樣性指數(shù)都在2.0以上。表明13份重樓屬種質(zhì)資源材料表型性狀的遺傳多樣性指數(shù)較高，供試各種質(zhì)在葉、花、根莖與株高的多個(gè)性狀均表現(xiàn)出豐富的多樣性，這種豐富的變異不僅為優(yōu)異種質(zhì)選擇提供源泉，而且為保護(hù)生物多樣性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

F值檢驗(yàn)可以看出，株高、根莖長(zhǎng)、基莖直徑、葉片數(shù)、葉片長(zhǎng)、葉片寬等15個(gè)性狀在群體間的差異達(dá)到極顯著(P<0.01)水平，萼片寬在群體間存在顯著(P<0.05)差異，根莖直徑和根莖干質(zhì)量在各種質(zhì)之間差異不顯著。表明野生種源在試驗(yàn)地經(jīng)過(guò)多代馴化栽培后，仍保留各自典型的性狀特征，各種質(zhì)材料間的大部分性狀差異明顯，僅根莖的質(zhì)量和粗壯程度與種質(zhì)來(lái)源無(wú)顯著關(guān)系。

2.2 主成分

本研究對(duì)供試樣本的18個(gè)表型性狀進(jìn)行了主成分分析，從而計(jì)算出這些表型性狀的特征值、方差貢獻(xiàn)率、累計(jì)貢獻(xiàn)率和因子載荷值等參數(shù)。在累計(jì)貢獻(xiàn)百分比高于85%時(shí)，共發(fā)現(xiàn)5個(gè)主成分(表2)。主成分1～5的特征值分別是5.947、5.217、2.383、1.414、1.044；主成分貢獻(xiàn)率分別是33.037%、28.984%、13.242%、7.855%、5.800%，前5個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到88.918%(表3)。第一主成分的總?cè)~面積、花梗長(zhǎng)、萼片長(zhǎng)、葉片長(zhǎng)、根莖直徑、基莖直徑、株高的特征向量值最大，且均為正值，可以理解為第一主成分是跟體型大小相關(guān)的綜合指標(biāo)；第二主成分的雄蕊數(shù)、萼片數(shù)、花柱裂的特征向量值最大，均為正值，是與花的特性相關(guān)的綜合指標(biāo)；第三主成分的根莖長(zhǎng)、根莖重的特征向量值最大，且均為負(fù)值，是與根莖有關(guān)的因子；第四主成分的花瓣長(zhǎng)的特征向量值最大；第五主成分的葉片數(shù)特征向量值最大。貢獻(xiàn)率較大的性狀是造成重樓表型差異的主要因素。以上主成分分析結(jié)果表明，株型大小的多樣性最高，其次是花部元件的數(shù)量。這些性狀因子可視為今后重樓種質(zhì)評(píng)價(jià)與雜交育種中親本選擇的主要表型指標(biāo)。

2.3 聚類(lèi)

13種重樓屬植物的聚類(lèi)分析結(jié)果如圖1所示，在卡方距離0.10處，將重樓樣本分為5個(gè)類(lèi)群。

第Ⅰ類(lèi)群包括毛重樓、球藥隔重樓、短瓣球藥隔重樓、啟良重樓、華重樓和長(zhǎng)藥隔重樓，該類(lèi)群個(gè)體高大，花梗長(zhǎng)于其他個(gè)體；其中華重樓和長(zhǎng)藥隔重樓性狀指標(biāo)最接近。

表2 重樓屬種質(zhì)材料18個(gè)表型性狀的主成分分析

表3 前5個(gè)主成分分析結(jié)果

第Ⅱ類(lèi)群包括亮葉重樓、黑籽重樓和金線(xiàn)重樓；此類(lèi)群株型中等、根莖干質(zhì)量高于其他種質(zhì)。黑籽重樓與金線(xiàn)重樓在株高、葉片數(shù)量、長(zhǎng)度寬度等性狀上表現(xiàn)極相似。

第Ⅲ類(lèi)群僅包含凌云重樓。凌云重樓直立莖、葉片、根莖、萼片等營(yíng)養(yǎng)器官的大小顯然不占優(yōu)勢(shì)，但其花柱裂、雄蕊數(shù)、萼片數(shù)在所有種質(zhì)材料中表現(xiàn)出較高值。

第Ⅳ類(lèi)群包括矮重樓和狹葉重樓，二者葉片數(shù)較多，葉面積小，幾乎無(wú)葉柄。

第Ⅴ類(lèi)群以多葉重樓獨(dú)立為一類(lèi)。表現(xiàn)為株型矮小，葉面積大，葉片數(shù)多。

2.4 主要數(shù)量性狀相關(guān)性

供試重樓種質(zhì)18個(gè)數(shù)量性狀的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，各性狀間普遍存在或顯著或極顯著相關(guān)性，表現(xiàn)為正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。與基莖直徑顯著相關(guān)的性狀最多，達(dá)到12個(gè)，株高、根莖干質(zhì)量、葉片數(shù)、葉片長(zhǎng)、萼片數(shù)、萼片長(zhǎng)、花梗長(zhǎng)、花瓣長(zhǎng)、雄蕊數(shù)、雄蕊長(zhǎng)、花柱裂、總?cè)~面積與基莖直徑都呈極顯著正相關(guān)；與葉片數(shù)、花梗長(zhǎng)、總?cè)~面積相關(guān)的性狀均為9個(gè)；與根莖長(zhǎng)度相關(guān)的性狀最少，只有株高與根莖長(zhǎng)度呈極顯著的正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，反映重樓產(chǎn)量的指標(biāo)根莖干質(zhì)量?jī)H與雄蕊數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)，與萼片數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，與地上部分的其他性狀沒(méi)有顯著相關(guān)關(guān)系。

圖1 基于18個(gè)性狀的重樓屬種質(zhì)資源聚類(lèi)

表4 重樓屬種質(zhì)資源表型性狀相關(guān)分析

注：*表示在P<0.05水平上顯著相關(guān)，**表示在P<0.01 水平上顯著相關(guān)。1，株高；2，根莖長(zhǎng)；3，根莖直徑；4，根莖干質(zhì)量；5，基莖直徑；6，葉片數(shù)；7，葉片長(zhǎng)；8，葉片寬；9，葉柄長(zhǎng)；10，萼片數(shù)；11，萼片長(zhǎng)；12，萼片寬；13，花梗長(zhǎng)；14，花瓣長(zhǎng)；15，雄蕊數(shù)；16，雄蕊長(zhǎng)；17，花柱裂；18，總?cè)~面積。

3 討論

本研究對(duì)恩施當(dāng)?shù)?3種重樓屬種質(zhì)進(jìn)行表型性狀多樣性分析、主成分分析、聚類(lèi)分析和性狀間的相關(guān)性分析。性狀多樣性分析結(jié)果顯示，參試種質(zhì)的葉、花、根莖與株高等多個(gè)性狀均表現(xiàn)豐富的多樣性，其中對(duì)重樓產(chǎn)量起決定性作用的根莖長(zhǎng)度、根莖最大直徑和根莖干質(zhì)量多樣性指數(shù)較高，說(shuō)明在育種工作中可利用現(xiàn)有種質(zhì)資源提高重樓的產(chǎn)量潛力。

從聚類(lèi)分析結(jié)果來(lái)看，毛重樓、球藥隔重樓、短瓣球藥隔重樓、啟良重樓、華重樓和長(zhǎng)藥隔重樓聚為一類(lèi)，與它們?cè)谥貥侵参锓诸?lèi)地位中均屬于南重樓組這一結(jié)論一致[6]。前人的研究還表明，啟良重樓、華重樓和長(zhǎng)藥隔重樓均為多葉重樓的變種，短瓣球藥隔重樓是球藥隔重樓的變種[6]，因?yàn)橛H緣關(guān)系近而具有相似的表型。多葉重樓在長(zhǎng)期的栽培過(guò)程中受到環(huán)境的影響，表型漸漸發(fā)生變化，與其變種的共性減少，可能是造成其單成一類(lèi)的原因。聚類(lèi)結(jié)果還顯示，黑籽重樓和金線(xiàn)重樓更容易較早地聚在一起，然而以上被試材料的ISSR分析結(jié)果顯示兩者遺傳相似度低，不能聚為一類(lèi)，這與李壯等[2]對(duì)重樓的遺傳多樣性研究中發(fā)現(xiàn)黑籽重樓和金線(xiàn)重樓親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的觀點(diǎn)有差異。

從主成分分析結(jié)果來(lái)看，葉片長(zhǎng)、葉片寬、植株高、根莖干質(zhì)量、萼片寬等5個(gè)性狀是引起種間表型差異的最主要因素，但這類(lèi)性狀參數(shù)僅僅在量上表現(xiàn)差異，且觀測(cè)值容易受環(huán)境影響，因此，本研究中將第2主成分貢獻(xiàn)較大的花萼數(shù)、雄蕊數(shù)和花柱裂3個(gè)表型性狀作為重樓種質(zhì)間差異的主要來(lái)源。這與翁周等[7]對(duì)多葉重樓的研究結(jié)果相一致。

表型性狀相關(guān)性分析顯示，植株的各繁殖器官性狀之間、各營(yíng)養(yǎng)器官性狀之間普遍具有極顯著相關(guān)性。而植株地下部分性狀與地上部分的某些性狀間存在一定相關(guān)性，這一結(jié)果與地黃種質(zhì)主要數(shù)量性狀的相關(guān)性分析結(jié)果相似[8-9]。也提示重樓地上部分的某些性狀可作為高產(chǎn)重樓種質(zhì)選育指標(biāo)。這一推論在重樓的相關(guān)研究中尚未見(jiàn)報(bào)道，但在甘草[10]、白芷[11]、黃芩[12]等中草藥植物表型性狀相關(guān)性分析中已得到證實(shí)。