張藝燦，劉鳳之，王海波

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧省落葉果樹礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)與肥料高效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 興城 125100）

磷是植株所必需的大量元素之一，參與植株光合作用、能量轉(zhuǎn)移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、大分子生物合成以及呼吸作用等過(guò)程［1-2］。然而，土壤中可供植株吸收的磷卻十分有限。這主要與磷元素在土壤中易被固定且吸收運(yùn)輸困難有關(guān)。土壤中有機(jī)磷含量約占總磷含量的20%～80%，主要為植素類、核酸類、磷酯類以及其他有機(jī)磷化合物。但是，這些有機(jī)磷需轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)磷后才能被植株吸收利用［3］。而土壤中約70%～90%無(wú)機(jī)磷會(huì)在吸附、沉淀、淋濕等過(guò)程中被土壤固定［4］。例如，在堿性土壤中大部分無(wú)機(jī)磷會(huì)與鈣鎂結(jié)合，形成不溶物，在酸性土壤中則會(huì)與鐵鋁結(jié)合，從而被固定在土壤中，難以移動(dòng)，不能被植株吸收［5］。因此，解決植株缺磷問(wèn)題的關(guān)鍵是減少土壤中固定磷元素的量，提高可溶性磷含量。

植株根際土壤中存在著大量微生物，它們與植株的生長(zhǎng)代謝密切相關(guān)。其中一類微生物可將土壤中不溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷并釋放到土壤中供給植株，即解磷微生物［6］。早在1903年，Stalstrom［7］即發(fā)現(xiàn)有些細(xì)菌可以溶解難溶性磷酸鹽以及磷礦石釋放出可溶性磷，這一發(fā)現(xiàn)在1948年被進(jìn)一步證實(shí)［8］，隨后受到了研究者們的廣泛關(guān)注。目前已報(bào)道的解磷微生物主要包括細(xì)菌、真菌、放線菌。其中細(xì)菌包括假單胞菌屬（Pseudomonas Migula 1894，237. Nom. Cons. Opon. 5，Jud.Comm. 1952，121）、腸桿菌屬（Enterobacter Hormaeche and Edwards 1960，72）、芽孢桿菌屬（Bacillus Cohn 1872，174；nom.-gen. cons. Nomencl.Comm. Intern. Soc. Microbiol. 1937，28；Opin. A. Jud.Comm. 1955，39）、歐文氏菌屬（Erwinia Winslow，Broadhurst，Buchanan，Krumwiede，Rogers and Smith 1920，209）、固氮菌屬（Azotobacter Beijerinck 1901，567）、根瘤菌屬（Rhizobium Frank 1889，338. Nom. gen. cons. Opin 34，Jud. Comm.1970，11）、生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter Brisou and Prévot 1954，727）、黃桿菌屬（Flavobacterium Bergey et al.，1923，97）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella Trevisan，1885，105）、微球菌屬（Micrococcus Cohn 1872，151）、氣單胞菌屬（Aeromonas Kluyver and van Niel 1936，398）、普羅威登斯菌屬（Providencia Ewing）、土壤桿菌屬（Agrobacterium Conn 1942，359. Nom. gen.cons. Opin. 33，Jud. Comm. 1970，10）、埃希氏菌屬（Escherichia Castellani and Chaumers 1919）、沙門氏菌屬（Salmonella Lign ié res 1990，389）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia Yabunchi et al）、無(wú)色桿菌屬（Achromobacter）、色桿菌屬（Chromobacterium Bergonzini 1881，153. Nom. gen. cons. Opin 16，Jud.Comm.，1958，152）、沙雷氏菌屬（Serratia Bizio 1823，288）、固氮螺菌屬（Azospirillum）、產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes Castellani and Chalmers 1919，936）、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、貪銅菌屬（Cupriavidusp）、葡萄球菌屬（Staphylo-coccus Rosenbach 1884，18 nom. cons. Opin 17 Jud.Comm. 1958，153）、黃色單胞菌屬（Flavimonas Holmes et al 1987）、纖維單胞菌屬［Cellulomonas（Bergey et al，1923）. Claek 1952］等 30 多個(gè)屬［9-14］；溶磷真菌包括曲霉菌（Aspergillus）、粉狀畢赤酵母（Picha farinose）、克魯斯假絲酵母（Candida krissii）、分枝毛霉（Mucor Ramosissimus）、小菌核菌（Sclerotinia ninor）、鐮刀菌（Fusarium）、擴(kuò)展青霉（Penicillum expansum）、根霉屬（Rhizopus）、青霉屬（Penicillium）、藍(lán)狀菌屬（Talaromyces）等［15-18］；溶磷放線菌則主要為鏈霉菌屬（Streptomyces Waksman and Henrici 1943，339）［19］。

目前，研究人員已從多種生態(tài)環(huán)境中分離培養(yǎng)出多種溶磷微生物，并驗(yàn)證了其對(duì)植株生長(zhǎng)具有明顯地促進(jìn)效應(yīng)（表1）。但，有關(guān)溶磷菌的促生機(jī)制研究仍不成體系，本文就近年來(lái)對(duì)溶磷菌的研究進(jìn)行了總結(jié)探討。

表1 部分溶磷菌促生效應(yīng)研究

1 溶磷菌可提高根際礦質(zhì)元素濃度，促進(jìn)植株生長(zhǎng)

礦質(zhì)元素在植株的生長(zhǎng)過(guò)程中具有十分重要的作用，缺素會(huì)抑制植株的生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致死亡。而溶磷微生物可在一定程度上提高根際礦質(zhì)元素含量從而促進(jìn)植株生長(zhǎng)（圖1）。Ogut等［27］在小麥上的研究發(fā)現(xiàn)，接種溶磷菌芽孢桿菌Bacillus sp. 后根際土壤及植株磷含量均顯著增加，且其他元素如鉀、鎂、鋅、錳等含量也顯著增加。在玉米根際接種溶磷菌L. fusiformis 31MZR，與對(duì)照相比，接菌顯著增加了土壤中氮及磷的含量［42］。從大豆根際中分離出溶磷菌并接種到百脈根植株上，植株中全氮、全磷含量均顯著增加［43］。表明，溶磷菌接種可顯著改善植株?duì)I養(yǎng)狀況，而礦質(zhì)元素含量的增加或與菌株的解磷能力相關(guān)。

根際酸化為溶磷菌的解磷機(jī)制之一。Halde等［44］在溶磷菌根瘤菌Rhizobium培養(yǎng)基中添加NaOH，發(fā)現(xiàn)菌種的解磷能力消失，說(shuō)明解磷能力或是由低pH值引起。后續(xù)的很多研究均表明，土壤（培養(yǎng)液）pH值與溶磷量呈顯著負(fù)相關(guān)［45-46］。解磷微生物可以分泌大量的有機(jī)酸，如檸檬酸、草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸等，以降低土壤pH值［47-49］。Huang 等［50］利用測(cè)序技術(shù)測(cè)定了溶磷菌B. megaterium strain JX285的全基因組序列，發(fā)現(xiàn)了與有機(jī)酸合成相關(guān)基因，如檸檬酸合成酶。李小冬等［51］利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)測(cè)定了不同磷源條件下陰溝腸桿菌（E. cloacae）的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)，多條與有機(jī)酸相關(guān)的代謝通路被上調(diào)表達(dá)，且在不同磷濃度下受誘導(dǎo)表達(dá)的有機(jī)酸種類不同。唐超西等［52］從黑曲霉的cDNA文庫(kù)中克隆得到了溶磷基因psg A，并將其轉(zhuǎn)移至E. coil HST08中發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌可分泌更多種類的有機(jī)酸并溶解磷酸三鈣。江紅梅［53］通過(guò)SMART技術(shù)，成功構(gòu)建了溶磷真菌草酸青霉的cDNA文庫(kù)，并獲得了4條具有穩(wěn)定溶磷功能的新基因片段，試驗(yàn)證明，4個(gè)克隆子可通過(guò)分泌有機(jī)酸來(lái)溶解難溶性磷。此外，有學(xué)者提出，葡萄糖酸的產(chǎn)生是溶磷菌溶磷的重要機(jī)制［54］。葡萄糖在葡萄糖脫氫酶（GDH）及其協(xié)同因子吡咯喹啉奎寧（PQQ）的作用下可轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸以溶解難溶性磷酸鹽［55］。Goldstein 等［56］從溶磷菌 E.herbicola 中克隆出了pqqE基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)無(wú)機(jī)磷的溶解。Ludue?a等［57］發(fā)現(xiàn)在缺失PQQ的突變體菌種中，葡萄糖酸產(chǎn)量降低了78%且溶磷能力減少了80%。不同溶磷菌株溶解磷酸的有機(jī)酸種類不同，或溶磷菌產(chǎn)生的有機(jī)酸的種類及數(shù)量不同，是其溶磷能力不同的主要原因［58］。

除有機(jī)酸外，一些無(wú)機(jī)酸，如H2S、HCl、H2CO3等的產(chǎn)生也可以溶解磷礦物以增加磷含量［59］。然而，Altomare等［60］在利用真菌溶解磷礦物時(shí)發(fā)現(xiàn)，此過(guò)程中并沒(méi)有檢測(cè)出有機(jī)酸，并且溶液pH值一直高于5，故降低根際環(huán)境pH值并不是溶磷菌溶磷的唯一途徑。Asea等［61］分別在添加與不添加NH4+的條件下，檢測(cè)P. fuscumde的溶磷能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)不添加NH4+時(shí)，菌種未表現(xiàn)出溶磷性。在呼吸作用或NH4+同化過(guò)程中產(chǎn)生的H+或?yàn)槟承┚N溶磷的唯一機(jī)制［62］。Reyes等［63］研究了不同碳源、磷源對(duì)青霉菌及其突變體的溶磷效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青霉菌的溶磷機(jī)制包括產(chǎn)生葡萄糖酸、檸檬酸或者H+泵，且這些機(jī)制的轉(zhuǎn)化受到氮、磷及碳源的影響。

圖1 溶磷微生物溶磷機(jī)理圖

除根際酸化外，溶磷微生物還可以通過(guò)螯合作用增加土壤中磷含量［9，64］。溶磷菌分泌的有機(jī)酸除直接酸解磷酸鹽外，還可利用自身的羥基和羧基螯合土壤中的金屬陽(yáng)離子，如Ca2+、Fe3+、Al3+等，以釋放出更多的磷酸根離子供植株吸收［65］。Kucey［66］通過(guò)在培養(yǎng)基中添加0.05 mol/L的陽(yáng)離子螯合劑二乙胺四乙酸（EDTA），發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出與接種溶磷微生物P. bilaji相同的溶磷效果，表明螯合作用也是解磷微生物解磷的重要機(jī)制之一。與有機(jī)酸的螯合作用相似，溶磷菌分泌的胞外多糖可與Al3+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Mg2+及 K+等陽(yáng)離子形成復(fù)合物以增加磷酸根離子的釋放［67］。Yi等［68］的研究表明，在有機(jī)酸存在的情況下，胞外多糖的分泌可進(jìn)一步增加培養(yǎng)基中可溶性磷含量，且兩者之間的協(xié)同作用效果取決于胞外多糖的種類和濃度。故胞外多糖的存在或可進(jìn)一步促進(jìn)磷的溶解。除有機(jī)酸與胞外多糖外，溶磷菌還可分泌另一種效率極高的螯合劑，即鐵載體。鐵載體是一類低分子量物質(zhì)，與Fe3+具有極高的親和性［69］。許多細(xì)胞膜受體都可以固定鐵/鐵載體復(fù)合物，從而增加鐵元素在植株內(nèi)的吸收效率以促進(jìn)植株生長(zhǎng)［70］。Ghavami等［71］研究發(fā)現(xiàn)，鐵載體除促進(jìn)鐵元素吸收外，也可促進(jìn)植株對(duì)鋅及磷元素的吸收。

解磷微生物可以分泌磷酸酶、磷酸水解酶、肌醇六磷酸酶等，這些酶可以催化有機(jī)磷的礦化［72］。將解磷微生物接種到鷹嘴豆上，發(fā)現(xiàn)土壤中酸性磷酸酶活性升高。且在低磷條件下，磷濃度與酸性磷酸酶活性呈顯著正相關(guān)［33］。劉春艷等［73］在枳（Poncirus trifoliata）上的研究發(fā)現(xiàn)，接種有益微生物叢枝菌根真菌（AM真菌）Funneliformis mosseae可顯著增加根系酸性磷酸酶的分泌并增強(qiáng)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（PtaPT3，PtaPT5 和PtaPT6）的表達(dá)以改善枳的磷素營(yíng)養(yǎng)。Sajidan等［74］已從Klebsiella sp.菌株中分離并克隆出了肌醇六磷酸酶基因（phy），且含有phy的菌株可顯著增強(qiáng)對(duì)肌醇六磷酸鹽的分解利用［75］。此外，溶磷微生物作為一個(gè)小型的磷庫(kù)，在細(xì)胞死亡時(shí)釋放出的磷素營(yíng)養(yǎng)可供給植株吸收利用［76］。但一些研究也表明，接種溶磷菌后增加了植株生物量及產(chǎn)量卻并未增加植株內(nèi)磷元素的含量。推測(cè)溶磷菌釋放出的磷可能被土壤中的其他微生物固定，或者受到了土壤理化性質(zhì)的影響，使得磷的移動(dòng)、吸收、吸附等過(guò)程中受阻［77］。溶磷菌的促生機(jī)制除增加礦質(zhì)元素吸收外，還存在其他機(jī)制且有待進(jìn)一步研究。

2 溶磷菌可合成激素，促進(jìn)植株生長(zhǎng)

植株生長(zhǎng)促進(jìn)細(xì)菌可合成植株生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，如赤霉素（gibberellin，GA）、細(xì)胞分裂素（cytokinin，CK）以及生長(zhǎng)素（auxin，IAA），它們可以直接或間接地為植株的生長(zhǎng)提供有利條件［78］。Bensidhoum等［79］的研究表明，溶磷菌P. fluorescens可合成IAA并促進(jìn)大麥的生長(zhǎng)。Oshnoei等［80］發(fā)現(xiàn)內(nèi)生溶磷菌B. firmus Bf172在代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生較多的IAA，且IAA含量與溶磷量、鐵載體以及蛋白酶的產(chǎn)生呈顯著正相關(guān)。Ludue?a 等［81］對(duì)溶磷菌 Serratia sp.S119進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其基因序列中含有編碼吲哚丙酮酸脫羧酶基因（indolepyruvate decarboxylase，ipdC）以及吲哚乙醛脫氫酶基因（indole-3-acetaldehyde dehydrogenase，dhaS），其在依賴色氨酸的IAA合成途徑中發(fā)揮著重要作用。此外，溶磷菌接種也可以刺激植株產(chǎn)生更多的IAA。Kudoyarova等［82］在小麥上接種溶磷菌P. illinoisensis后，促進(jìn)了植株體內(nèi)IAA的合成，并進(jìn)一步刺激根系生長(zhǎng)使得植株捕獲磷素的能力增強(qiáng)，從而顯著增加了植株的生物量，這一過(guò)程與溶磷菌自身產(chǎn)生的IAA并不相關(guān)。溶磷菌刺激植株生長(zhǎng)可能存在兩種模式，即自身合成IAA與誘導(dǎo)植株合成IAA。

GA在種子萌發(fā)、開(kāi)花、結(jié)實(shí)、休眠、衰老等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［83-84］。外源施用GA可增強(qiáng)植株的生長(zhǎng)［85］。Joo等［86］發(fā)現(xiàn)溶磷菌 Burkholderis sp. KCTC 11096BP可以產(chǎn)生多個(gè)種類的GA。Ku等［87］研究表明，溶磷菌B. cereus合成的GA可促進(jìn)植株生長(zhǎng)。此外，溶磷菌產(chǎn)生的GA會(huì)影響植株體內(nèi)其它激素的含量，從而引起激素網(wǎng)絡(luò)的變化以調(diào)控植株的生長(zhǎng)［88］。Zhao等［89］發(fā)現(xiàn)溶磷菌T.asperellum Q1可以合成植物激素IAA、GA及脫落酸（abscisic acid，ABA），并且可提高黃瓜內(nèi)IAA、GA及ABA含量，增強(qiáng)根系生長(zhǎng)，提高根系活力。將溶磷菌Promicromonospora sp. SE188接種到番茄根際中，發(fā)現(xiàn)溶磷菌可以合成GA，并誘導(dǎo)植株內(nèi)GA及水楊酸的合成，抑制ABA的合成，以促進(jìn)植株生長(zhǎng)，抵抗病蟲危害［90］。另一方面，溶磷菌產(chǎn)生的激素可促進(jìn)根系分泌物的產(chǎn)生，從而為根際微生物的生長(zhǎng)提供更多的物質(zhì)來(lái)源［91］。

3 溶磷菌可促進(jìn)根系發(fā)育，改善根系構(gòu)型

Hinsinger等［92］指出，土壤中磷素的缺乏并不是植株吸收磷的能力有限，而是磷在土壤中的移動(dòng)受阻，所以植株會(huì)通過(guò)增大根系面積來(lái)增加吸收面積。一些研究表明，溶磷菌接種可改善植株的根系形態(tài)。在扁穗雀麥根際接種溶磷菌后發(fā)現(xiàn)植株根系表現(xiàn)為主根變短、根數(shù)變多［93］。王志剛等［94］在西瓜上接種溶磷菌P. ananatis后，發(fā)現(xiàn)接種處理顯著增加了西瓜幼苗總根長(zhǎng)、根表面積及根系體積。在花生根際接種溶磷菌促進(jìn)了根系發(fā)育，根長(zhǎng)、根尖數(shù)以及根體積顯著增加［95］。溶磷菌合成及誘導(dǎo)植株產(chǎn)生IAA則為根系系統(tǒng)發(fā)育提供了有利條件［96］。植株促生細(xì)菌P. brassicacearum可以顯著促進(jìn)野生擬南芥?zhèn)雀纳L(zhǎng)，但在生長(zhǎng)素運(yùn)輸和響應(yīng)突變體植株上并無(wú)此效應(yīng)，說(shuō)明IAA對(duì)于側(cè)根的生長(zhǎng)是必不可少的［97］。此外，蔡璐等［23］在白三葉草上發(fā)現(xiàn)，接種溶磷菌抑制了根系生長(zhǎng)，這可能與溶磷菌和植株的作用模式相關(guān)，具體的機(jī)制需進(jìn)一步探討。

4 溶磷菌可改善光合系統(tǒng)，提高光合效率

溶磷菌接種可顯著改善植株的光合作用。Elkoca等［98］在鷹嘴豆上接種溶磷菌B. megaterium M-3，發(fā)現(xiàn)接菌后植株葉綠素含量顯著增加，生長(zhǎng)增強(qiáng)。在水稻上接種溶磷菌Bacillus sp.顯著增加了植株的光合作用［99］。余旋等［100］在山核桃上分別接種溶磷菌綠針假單胞菌、熒光假單胞菌以及蠟樣芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)接種處理均表現(xiàn)出較高的凈光合速率。光合系統(tǒng)的改善與植株體內(nèi)礦質(zhì)元素尤其是鐵的含量相關(guān)，Pinto等［101］表明礦質(zhì)元素含量會(huì)影響葉綠素以及類胡蘿卜素的含量。此外，Zhang等［102］表明根際促生菌可通過(guò)調(diào)節(jié)植株內(nèi)源糖/ABA信號(hào)來(lái)提高擬南芥的光合效率。故，光合效率的提升或?yàn)橹仓隊(duì)I養(yǎng)的改善、內(nèi)源激素含量變化共同作用的結(jié)果。此外，光合系統(tǒng)的改善會(huì)產(chǎn)生更多的光合產(chǎn)物并以根系分泌物形式釋放到土壤中，從而吸引更多的根際微生物定殖以豐富根際的菌落組成［103］。

5 溶磷菌可改善根際微生物群落結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力

溶磷菌在根際接種后會(huì)引起微生物群落結(jié)構(gòu)變化。土壤中三大微生物比例是衡量土壤肥力的重要指標(biāo)，細(xì)菌數(shù)量增加可顯著提高土壤中氮和磷含量，放線菌可顯著促進(jìn)有機(jī)質(zhì)的分解、促進(jìn)植物激素的產(chǎn)生，而真菌數(shù)量與土壤肥力呈顯著負(fù)相關(guān)［104-105］。余旋等［106］在山核桃上分別接種溶磷菌綠針假單胞菌、熒光假單胞菌以及蠟樣芽孢桿菌后，發(fā)現(xiàn)根際細(xì)菌及放線菌數(shù)量增加，而真菌的數(shù)量減少，土壤肥力顯著提高。張?jiān)葡嫉龋?07］研究發(fā)現(xiàn)，接種溶磷菌B. subtilis JT-1可顯著提高土壤微生物數(shù)量，豐富微生物種類，提高土壤活力。在大豆根際添加溶磷菌后，土壤中細(xì)菌、解磷菌以及氨化細(xì)菌的數(shù)量均顯著增加［108］。在施用溶磷微生物菌肥后，改變了植株根際細(xì)菌群落組成，并增加了功能微生物的豐富度［109］。此外，溶磷菌接種還可促進(jìn)土壤AM真菌對(duì)植物根系的侵染［110］。由此可知，溶磷菌接種到根際后，對(duì)根際微生物環(huán)境產(chǎn)生了重要影響。

根際微生物菌落結(jié)構(gòu)的變化可能與根際環(huán)境及植株?duì)I養(yǎng)狀態(tài)有關(guān)。Estrada-Bonilla 等［111］在堆肥研究中發(fā)現(xiàn)，pH值與微生物種群的變化密切相關(guān)，推測(cè)，溶磷菌接種通過(guò)改變根際pH值從而影響根際微生物群落結(jié)構(gòu)。變形菌門、酸桿菌門以及放線菌門是不同類型土壤的優(yōu)勢(shì)菌落，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)這些優(yōu)勢(shì)菌種在土壤中的豐度與土壤速效磷含量及土壤酶活變化有關(guān)［112］。溶磷菌接種后引起的速效磷含量增加以及土壤酶活的變化也可能誘導(dǎo)了微生物群落的改變。此外，溶磷菌接種可改善根系構(gòu)型，從而為根際細(xì)菌的侵染定殖提供了更大的空間。

6 展望

溶磷微生物作為重要的生物資源，在減少磷肥施用，改善土壤，促進(jìn)植株生長(zhǎng)中發(fā)揮著重要作用。然而，目前有關(guān)溶磷微生物的促生機(jī)制研究仍停留在表觀物質(zhì)變化研究并在推廣使用中存在較多問(wèn)題。接下來(lái)可從以下3方面進(jìn)行深入研究：（1）利用全基因組測(cè)序技術(shù)解析溶磷微生物的基因序列，尋找溶磷促生相關(guān)基因，并利用分子生物學(xué)手段鑒定基因功能，為溶磷微生物的快速篩選提供理論依據(jù)。（2）尋找更加有效的分離培養(yǎng)土壤微生物的方法以獲得更加豐富的菌種資源。（3）運(yùn)用分子生物學(xué)手段尋找溶磷微生物的“最佳伴侶”，以組合形式接入到根際土壤中，以提高溶磷微生物的定殖率。