劉茜(譜尼測試集團(tuán)上海有限公司，上海 200233)

0 引言

海洋微生物在海洋生態(tài)環(huán)境中具有極其重要作用，在全球生物地球化學(xué)過程以及生態(tài)環(huán)境的自然修復(fù)中，有著舉足輕重的地位。海洋沉積物中微生物組成復(fù)雜，不同海水區(qū)域，其微生物群落變化明顯。近代人類不可持續(xù)生產(chǎn)及生活方式，使海洋環(huán)境遭受嚴(yán)重污染。海水養(yǎng)殖業(yè)、工業(yè)污水排入、地表徑流及河流流入等，均給近海生態(tài)環(huán)境帶來影響。海洋沉積物異養(yǎng)菌總數(shù)在近岸污染生態(tài)基線(背景)調(diào)查和環(huán)境質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)中，也作為必檢項(xiàng)目給予監(jiān)測[1]。

測量不確定度是與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，用以表征合理賦予被測量值的分散性。CNAS—CL07：2011《測量不確定度的要求》對(duì)檢測實(shí)驗(yàn)室要求，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)每一項(xiàng)有數(shù)值要求的測量結(jié)果進(jìn)行測量不確定度評(píng)估，尤其要求在開展新的檢測方法時(shí)，或在客戶有要求時(shí)，或用來確定是否符合某規(guī)范所依據(jù)的誤差限的寬窄時(shí)[2]。在目前關(guān)于微生物檢測不確定度的研究中，幾乎找不到關(guān)于海洋沉積物異養(yǎng)菌總數(shù)測量不確定度的相關(guān)報(bào)道。由于微生物在樣品中分布的不均勻性，及海洋沉積物微生物組成的復(fù)雜性，測量不確定度的研究顯得尤為重要。CNAS—CL09：2013《檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明》要求在微生物檢測領(lǐng)域，某些情況下，一些檢測無法從計(jì)量學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)角度對(duì)測量不確定度進(jìn)行有效而嚴(yán)格的評(píng)估，這時(shí)至少應(yīng)通過分析方法，考慮它們對(duì)于檢測結(jié)果的重要性，列出各主要的不確定度分量，并做出合理的評(píng)估。有時(shí)在重復(fù)性和再現(xiàn)性數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上估算不確定度也是合適的[3]。本文參考各方資料，對(duì)海洋沉積物異養(yǎng)菌總數(shù)測量不確定度進(jìn)行分析考察。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備

電子天平，型號(hào)JA21002，精度為0.1g，上海良平儀器儀表有限公司。

培養(yǎng)箱，型號(hào)MJX-250B-Z，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

凈化工作臺(tái)，型號(hào)SW-CJ-1F，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

立式壓力蒸汽滅菌器，型號(hào)YXQ-LS-100SII，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

無菌培養(yǎng)皿，直徑90mm。無菌錐形瓶，容量250mL、500mL。微量移液器及無菌吸頭。

1.2 試劑與材料

2216E 培養(yǎng)基，購于青島海博生物技術(shù)有限公司。樣品，海洋沉積物底泥來源于上海市南匯。

1.3 操作步驟

樣品制備：取海洋沉積物底泥，取樣前盡可能混合均勻。

檢測步驟 ：操作參考GB 17378.7—2007 海洋監(jiān)測規(guī)范 第7 部分：近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測 附錄F 的方法。無菌稱取1.0g 沉積物(底泥)樣品，然后加入9mL 無菌海水，混勻；無菌操作吸取混勻后的混合樣1mL，加入到盛有9mL 無菌陳海水的試管內(nèi)混勻，并依同法依次連續(xù)稀釋至所需稀釋度。選擇2～3個(gè)適宜的稀釋度樣品勻液，吸取0.1mL 分別加入預(yù)先制備好的2216E 培養(yǎng)基平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度接種三塊平皿。用滅菌不銹鋼涂布棒涂布均勻，平皿置于超凈工作臺(tái)靜置20～30min，待樣液滲入培養(yǎng)基后，將此平皿移入恒溫箱25℃培養(yǎng)7 天，取出計(jì)數(shù)平板上菌落[1]。

1.4 菌落計(jì)數(shù)與計(jì)算結(jié)果

選取菌落數(shù)在30～300 范圍內(nèi)稀釋度的平皿進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[1]。細(xì)菌總數(shù)為3 塊平板菌落數(shù)的平均值，再乘以稀釋倍數(shù)。出現(xiàn)其他計(jì)數(shù)情況，按標(biāo)準(zhǔn)中要求進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 不確定度分析

2.1 不確定度的主要來源分析

微生物計(jì)數(shù)的測量不確定的評(píng)估一般采取整體法進(jìn)行評(píng)估。以便控制結(jié)果來源的各個(gè)測試程序。整體法可看作是一個(gè)“黑匣子”系統(tǒng)[4]，對(duì)不確定度的主要來源均包含在其中，現(xiàn)對(duì)各來源進(jìn)行分析，以確定對(duì)本測試有影響的重要分量。

2.1.1 取樣及次級(jí)取樣

從大量的待測樣品中取出測試單元的步驟，是總誤差的重要組成部分。但是該部分并不是測量本身不確定度的組成部分，因此在本分析中不予考慮。次級(jí)取樣是指從分析樣品中取出的測試部分，本測試中為初始懸液的制備。海洋沉積物中微生物種類豐富組成復(fù)雜，分布不均勻，個(gè)體差異較大，因此方案需考慮次級(jí)取樣的因素。

2.1.2 樣品的質(zhì)量

樣品質(zhì)量的不確定評(píng)定可通過不確定傳播的方式來獲得，即通過天平的不確定度。但是在微生物檢測中，樣品的質(zhì)量因素對(duì)測量不確定度的貢獻(xiàn)較小，因此該因素一般不作為結(jié)果不確定度的主要來源。

2.1.3 微生物在樣品中的分布及數(shù)量

狀態(tài)一致的樣品會(huì)由于污染情況不同，而出現(xiàn)不同分布。試驗(yàn)前的樣品應(yīng)盡可能混勻，但是由于微生物間或微生物與設(shè)備間有相互吸引或相互排斥的傾向，導(dǎo)致樣品中的微生物過度離散，呈現(xiàn)隨機(jī)分布。按照統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，其最終結(jié)果還是會(huì)呈現(xiàn)泊松分布?；谫Y料，一般不對(duì)低含量樣本的不確定度進(jìn)行考察，因?yàn)楫?dāng)含量過低時(shí)，重復(fù)性和再現(xiàn)性很難測量，不確定度沒有簡單統(tǒng)一的方法來評(píng)定。

2.1.4 操作方式

分析過程中的一系列因素，如不同稀釋倍度結(jié)果的差異、同一稀釋度不同平板計(jì)數(shù)的差別、人員對(duì)平板菌落觀察結(jié)果計(jì)數(shù)的差別、檢測時(shí)間、設(shè)備培養(yǎng)溫度的差異及培養(yǎng)基等因素，是不確定度貢獻(xiàn)的主要來源。對(duì)于隨機(jī)誤差，可能來源于人員操作手法及設(shè)備的使用，在重復(fù)性條件下實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部進(jìn)行評(píng)定時(shí)可給予考慮。另外，因分析步驟直接決定測量結(jié)果，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)本次實(shí)驗(yàn)不考慮偏倚因素。

2.2 建立數(shù)學(xué)模型[5]

測量中，設(shè)被測量異養(yǎng)菌總數(shù)為Y，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為X，則Y=X。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法的確認(rèn)與實(shí)施

本實(shí)驗(yàn)方案為取不同濃度的沉積物基質(zhì)樣品，每份樣品分為A、B 兩組不同實(shí)驗(yàn)員。因微生物濃度在樣品基質(zhì)中不穩(wěn)定，會(huì)隨時(shí)間變化有所改變，所以本方案中無法考慮不同分析時(shí)間帶入的影響。為盡可能得到不同的A、B 情況、兩組人員采用不同滅菌批次的培養(yǎng)基試劑、不同的操作臺(tái)、不同的移液器、不同的培養(yǎng)箱，以覆蓋人員、培養(yǎng)基配制、設(shè)備溫度等因素所引起的操作條件的變化。

對(duì)樣品分別準(zhǔn)備的10 組待測樣品，每組樣品重復(fù)測試2次。根據(jù)GB 17378.7—2007 進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

樣品不確定度計(jì)算：樣品10 組結(jié)果取對(duì)數(shù)，計(jì)算再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差結(jié)果見表1。

表1 樣品再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算

式中：SR為再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差；yij為對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換值(lg(CFU/mL))；n為給定基質(zhì)樣品數(shù)量；i 為樣品的序號(hào)，i=1～n；j 為再現(xiàn)性條件的編號(hào)，j=A 或j=B。測試結(jié)果以Y=lgX 表示，再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差以SR表示，在包含因子為2(置信水平95%)時(shí)，則擴(kuò)展不確定度為：U=2SR=0.18

2.4 結(jié)果報(bào)告

每組樣品結(jié)果以區(qū)間的形式表示為lgXi-0.18≤lgXi≤lg+0.18，取反對(duì)數(shù)得到每一樣品微生物含量的區(qū)間。以第1 組測試樣品為例，lgX 的取值范圍為2.65≤lgX1A≤3.01，該測試樣品異養(yǎng)菌總數(shù)取對(duì)數(shù)值得到微生物含量X1A的所在區(qū)間為447≤X1A≤1023。

3 討論

本文依據(jù)GB 17378.7 平板計(jì)數(shù)表面涂抹法對(duì)海洋沉積物異養(yǎng)菌總數(shù)進(jìn)行測定，依據(jù)JJF1059.1—2012《測量不確定度評(píng)定與表示》、RB/T 151—2016《食品微生物定量檢測的測量不確定度評(píng)估指南》等資料，對(duì)測量結(jié)果不確定度進(jìn)行分析，建立了海洋沉積物異養(yǎng)菌總數(shù)不確定度的評(píng)估方法。由于微生物數(shù)據(jù)的發(fā)散性較大，平板計(jì)數(shù)呈偏態(tài)分布，需要先將檢測結(jié)果取對(duì)數(shù)，轉(zhuǎn)化為正態(tài)分布后使用。由于x 和lgx 之間的非線性關(guān)系，計(jì)算得到的擴(kuò)展不確定度U 不能直接換算到x，因此只能給出測定結(jié)果的可能區(qū)間。

4 結(jié)語

綜上所述，本文建立的不確定度評(píng)估方法，可為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理及評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。對(duì)于不確定度的主要來源文中已詳細(xì)介紹，在此不再贅述。實(shí)驗(yàn)室在操作過程中，應(yīng)關(guān)注各影響因素，一方面加強(qiáng)試劑耗材及關(guān)鍵性設(shè)備的質(zhì)量驗(yàn)收，另一方面提高檢測人員的操作技能，以降低隨機(jī)誤差。