陳蘇丹，汪亞祺，李秀珍，李學強

(河南科技大學 林學院，河南 洛陽 471023)

0 引言

款冬(TussilagofarfaraL.)為菊科千里光族款冬屬的多年生藥用草本植物，別名冬花、看燈花、九九花等，是中國傳統(tǒng)的中藥材[1]?？疃曰ɡ偃胨帲湫詼匚缎?，具有潤肺下氣、化痰止咳[2]的功效。臨床用于治療咳嗽痰多、新久咳嗽、支氣管炎、肺結核和咳吐膿血等癥[3]，藥用價值突出。

近年的研究表明：款冬的主要化學成分有萜類、黃酮類、多糖、有機酸、揮發(fā)油和生物堿類等[4]。其中，款冬中的黃酮類化合物含量較高且種類豐富[5]，主要以苷類形式存在，具有抗菌消炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、清熱解毒、降壓、利尿、強心鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛等多種藥理活性[6]，是款冬發(fā)揮藥效的一種重要生物活性成分[7]。目前，對款冬總黃酮的研究多集中于分離純化[8-9]、含量測定[10]、微波法輔助提取[11]、提取優(yōu)化及降脂作用[12]等方面，而利用超聲輔助法提取款冬總黃酮的報道很少。由于超聲波具有特殊的生物效應，選擇合適的超聲參數(shù)能使植物的細胞壁間形成較多的小孔[13]，從而增強細胞膜的通透性及選擇性[14]，現(xiàn)已廣泛用于提取植物中的生物活性成分[15]。本文采用超聲輔助法提取款冬總黃酮，并對其體外抗氧化活性進行初步研究，以期為款冬的充分開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗材料為款冬花蕾，于2019年1月在河南省三門峽市盧氏縣采集，將花蕾去除花梗和泥沙，陰干。粉碎后過60目篩，干粉備用。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH·)、維生素C、無水乙醇、濃鹽酸、硫酸亞鐵、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等試劑均為國產(chǎn)分析純，蘆丁標準品為色譜純，購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1 標準曲線的繪制

準確稱取2.5 mg蘆丁標準品，用體積分數(shù)為70%的乙醇定容至25 mL，得0.1 mg·mL-1的蘆丁溶液。分別移取蘆丁溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL置于10 mL試管中，加入5%(質量分數(shù))亞硝酸鈉溶液0.5 mL后靜置6 min；加入10%(質量分數(shù))硝酸鋁溶液0.5 mL后靜置6 min；加入4%(質量分數(shù))氫氧化鈉溶液4 mL，用70%(體積分數(shù))乙醇溶液定容后靜置15 min。以不加蘆丁標準品的溶液為空白對照。在波長510 nm處測定樣品的各吸光值[16]，以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程為Y=18.711X-0.000 3，r2=0.999 1，表明蘆丁在0.008 3～0.047 9 mg·mL-1線性關系良好，可用于款冬總黃酮質量濃度的測定。

1.2 款冬總黃酮提取率的測定

精密稱取0.5 g款冬花蕾粉末置于50 mL的三角瓶中，在所設定的條件下進行超聲(超聲功率500 W)輔助提取，提取完成后趁熱過濾，濾渣沖洗3次，濾液置于100 mL容量瓶中，用70%(體積分數(shù))乙醇定容，得供試液，在波長510 nm處測定吸光值。按以下公式計算款冬總黃酮提取率：

(1)

其中：C為根據(jù)標準曲線計算出的款冬總黃酮質量濃度，mg·mL-1；N為稀釋倍數(shù)；V為定容體積，mL；M為款冬花蕾干粉的的質量，g。

1.3 款冬總黃酮提取工藝的單因素試驗

在超聲時間分別為10 min、20 min、30 min、40 min和50 min的條件下比較提取效果，超聲溫度為50 ℃，乙醇體積分數(shù)為70%，料液比(體積比，下同)為1∶35。確定超聲時間為40 min的提取效果較好后，在超聲溫度分別為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃的條件下比較提取效果，乙醇體積分數(shù)為70%，料液比為1∶35。確定超聲溫度為50 ℃的提取效果較好后，在料液比分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35和1∶40的條件下比較提取效果，乙醇體積分數(shù)為70%，超聲時間為40 min。確定料液比為1∶35的提取效果較好后，選擇在乙醇體積分數(shù)分別為50%、60%、70%、80%和90%的條件下比較提取效果，超聲時間為40 min，超聲溫度為50 ℃，從而確定各因素的最佳水平。

1.4 款冬總黃酮提取工藝的正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，選擇乙醇體積分數(shù)(A)、料液比(B)、超聲溫度(C)和超聲時間(D)為考察因素，以款冬總黃酮的提取率為評價指標，采用正交試驗L9(34)選取最優(yōu)提取工藝條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平

1.5 方法重現(xiàn)性試驗

為進一步驗證經(jīng)過數(shù)據(jù)方差分析所得的最優(yōu)工藝條件的穩(wěn)定性和可靠性，在最優(yōu)工藝條件下進行款冬總黃酮提取率測定試驗，同時做5個平行樣品，計算相對標準偏差。

1.6 款冬總黃酮的抗氧化活性研究

分別配制質量濃度為0.02 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1和0.06 mg·mL-1的款冬總黃酮提取液，參照文獻[17-19]，測定其對DPPH·、羥基自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O2-·)的清除能力。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均進行3次重復，結果取平均值，數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和SPSS20軟件分析處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 超聲時間對款冬總黃酮提取率的影響

超聲時間對款冬總黃酮提取率的影響見圖1。由圖1可知：超聲時間為10～40 min時，款冬總黃酮提取率的增加較為明顯。當超聲時間為40 min時，款冬總黃酮的提取率最高，為6.59%。當超聲時間為50 min時，款冬總黃酮提取率下降至5.48%。可能原因是：超聲時間較短時，款冬總黃酮提取不充分；延長超聲時間，款冬總黃酮則不斷地溶出并進入溶液，從而提高了提取率。但經(jīng)過一定的提取時間后，款冬總黃酮已基本溶出，若超聲時間過長，會使款冬中大量非黃酮類物質溶出，導致總黃酮的提取率降低，耗能增加。

2.1.2 超聲溫度對款冬總黃酮提取率的影響

超聲溫度對款冬總黃酮提取率的影響見圖2。由圖2可以看出：在超聲溫度為30～50 ℃時，隨著超聲溫度的提高，款冬總黃酮的提取率逐漸增加，從4.41%升高至6.06%。而超聲溫度進一步升高到60 ℃和70 ℃時，款冬總黃酮提取率則呈下降趨勢。分析其原因，可能是總黃酮在乙醇溶液中的溶解度隨著超聲溫度的升高而增加，當溫度升高時，分子運動會加快，擴散速率增加，使得總黃酮的提取率增加。但超聲溫度過高時，會破壞總黃酮的結構，使總黃酮的活性受到影響，同時增加了非黃酮類物質的溶出量，因此，造成款冬總黃酮的提取率下降。

圖1 超聲時間對款冬總黃酮提取率的影響

圖2 超聲溫度對款冬總黃酮提取率的影響

2.1.3 料液比對款冬總黃酮提取率的影響

料液比對款冬總黃酮提取率的影響見圖3。由圖3可知：在料液比為1∶20～1∶35時，隨著料液比的減小，款冬總黃酮的提取率呈增加趨勢，說明溶劑用量的增多有利于款冬黃酮類物質的溶出。當料液比為1∶35時，款冬總黃酮提取率最大，為6.68%。之后，隨著溶劑用量進一步增加，料液比為1∶40時，款冬總黃酮提取率下降為6.23%。分析其原因，可能是由于款冬中的醇溶性與脂溶性雜質溶出量隨溶劑用量的增加而增多，影響黃酮類物質的溶出，從而降低款冬總黃酮的提取率。

2.1.4 乙醇體積分數(shù)對款冬總黃酮提取率的影響

乙醇體積分數(shù)對款冬總黃酮提取率的影響見圖4。由圖4可知：款冬總黃酮的提取率隨著乙醇體積分數(shù)的提高而明顯增加，當乙醇體積分數(shù)為60%時，款冬總黃酮的提取率達到最高，為6.46%。而隨著乙醇體積分數(shù)繼續(xù)提高，款冬總黃酮的提取率則不斷下降。這表明，在乙醇體積分數(shù)較低的情況下，醇溶性物質的溶出量會隨著乙醇體積分數(shù)的增加而增加，款冬總黃酮提取率也隨之增大。但若乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大，款冬中的一些醇溶性和脂溶性雜質溶出量增加，溶液的黏度增大，款冬總黃酮向溶劑中的擴散阻力增大，擴散減慢，提取率下降。

圖3 料液比對款冬總黃酮提取率的影響

圖4 乙醇體積分數(shù)對款冬總黃酮提取率的影響

2.2 正交試驗結果與分析

經(jīng)超聲時間、超聲溫度、料液比和乙醇體積分數(shù)等單因素試驗，確定款冬總黃酮提取的最優(yōu)條件，采用L9(34)正交試驗法進行試驗，正交試驗設計與結果分析如表2所示。正交試驗的極差(R)表現(xiàn)為A>C>B>D，表明各因素對款冬總黃酮提取率的影響順序由大到小依次為：乙醇體積分數(shù)>超聲溫度>料液比>超聲時間?？疃傸S酮提取的最優(yōu)工藝條件組合為A3B3C2D3，即乙醇體積分數(shù)為70%，料液比為1∶40，超聲溫度為50 ℃，超聲時間為50 min。由于正交試驗中沒有出現(xiàn)此最優(yōu)組合，因此要對所得的最優(yōu)組合進行驗證試驗。重復5次款冬總黃酮提取率測定試驗，測得款冬總黃酮提取率為8.02%，高于表2中最高的總黃酮提取率(7.50%)，相對標準偏差為0.79%，證明該工藝條件穩(wěn)定可行，適用于款冬總黃酮的提取。

根據(jù)方差分析的結果可知：A(乙醇體積分數(shù))和C(超聲溫度)對款冬總黃酮的提取率有顯著影響(P<0.05)，而B(料液比)和D(超聲時間)對款冬總黃酮提取率影響不顯著。

表2 正交試驗設計與結果分析

2.3 款冬總黃酮抗氧化活性分析

圖5 款冬總黃酮和維生素C對DPPH·的清除作用

款冬總黃酮和維生素C對DPPH·的清除作用見圖5。圖5表明：當款冬總黃酮的質量濃度為0.02～0.06 mg·mL-1時，隨著款冬總黃酮質量濃度的增大，其對DPPH·的清除率逐漸升高，清除率與款冬總黃酮質量濃度之間存在一定的量效關系。當款冬總黃酮的質量濃度為0.06 mg·mL-1時，對DPPH·的清除率達到最高，為81.03%。雖然款冬總黃酮清除DPPH·的能力稍弱于維生素C清除DPPH·的能力，但款冬總黃酮依舊表現(xiàn)出較強的清除DPPH·的能力，說明所提取的款冬總黃酮具有較好的抗氧化能力?？疃傸S酮和維生素C對·OH的清除作用見圖6。由圖6可以看出：款冬總黃酮對·OH的清除率隨著質量濃度的增加而逐漸增大。當款冬總黃酮的質量濃度為0.06 mg·mL-1時，對·OH的清除率達到最高，為44.59%。盡管款冬總黃酮清除·OH的能力弱于維生素C，但款冬總黃酮也表現(xiàn)出一定的清除·OH的能力。O2-·在活性氧的形成中起重要作用，為防止其造成的氧化損傷，需要加入抗氧化劑對其進行清除。因此，可通過測定抗氧化劑對O2-·的清除能力來判斷抗氧化劑的抗氧化能力。款冬總黃酮和維生素C對O2-·的清除作用見圖7。由圖7可知：款冬總黃酮的質量濃度越大，對O2-·的清除率越高，呈明顯的劑量效應關系。當款冬總黃酮質量濃度為0.06 mg·mL-1時，對O2-·的清除率達到最高，為83.34%。與相同質量濃度的維生素C相比，款冬總黃酮清除O2-·的能力雖然稍弱于維生素C，但款冬總黃酮仍表現(xiàn)出較強的清除O2-·的能力。

圖6 款冬總黃酮和維生素C對·OH的清除作用

圖7 款冬總黃酮和維生素C對O2-·的清除作用

綜合分析，當款冬總黃酮質量濃度為0.06 mg·mL-1時，對DPPH·、·OH和O2-·的清除率均達到最高，款冬總黃酮對DPPH·和O2-·具有較強的清除能力，對·OH具有一定的清除能力，說明款冬總黃酮具有良好的抗氧化活性。

3 討論與結論

款冬總黃酮最優(yōu)提取工藝條件為乙醇體積分數(shù)70%、料液比1∶40、超聲溫度50 ℃、超聲時間50 min。在此工藝條件下，款冬總黃酮提取率為8.02%。文獻[12]以產(chǎn)自吉林省臨江市的款冬為材料，得到在乙醇體積分數(shù)為 80%、料液比 1∶41、超聲溫度58 ℃、提取時間30 min的條件下，款冬總黃酮提取率最大，為 7.18%，本文的提取率高于該結果。文獻[10]研究表明：來自河北、山東、內蒙古、貴州、廣西等不同產(chǎn)地的款冬總黃酮提取率為4.2%～8.0%，本文研究結果與此接近。提取率略有不同主要是由于試驗所用的款冬來自不同的產(chǎn)地，其總黃酮含量存在差異，這與不同地區(qū)的土壤、海拔、生態(tài)環(huán)境和氣候條件等相關。文獻[11]采用微波法提取款冬總黃酮，提取率為9.70%，稍高于本文結果，原因可能是除試驗材料的來源地不同外，也與提取工藝有關。從整體來看，超聲輔助提取具有穩(wěn)定可靠、快速、便捷、提取率高等特點，適用于款冬總黃酮的提取。

抗氧化試驗表明：款冬總黃酮對O2-·和DPPH·具有較強的清除能力，對·OH具有一定的清除能力。當款冬總黃酮質量濃度為0.02～0.06 mg·mL-1時，對3種自由基的清除能力均隨款冬總黃酮質量濃度的增加而增強。當款冬總黃酮質量濃度為0.06 mg·mL-1時，對DPPH·、·OH和O2-·的清除率均達到峰值，分別為81.03%、44.59%和83.34%。文獻[20]研究表明：刺槐花總黃酮具有較強的抗氧化性，當刺槐花總黃酮質量濃度為0.47 mg·mL-1時，對DPPH·、·OH和O2-·的清除率分別達到88.04%、34.41%和59.07%。文獻[21]報道：無花果葉片總黃酮提取液對DPPH·和·OH的清除率分別達到66.67%和30.49%，證明無花果葉片具有較好的體外抗氧化能力。與這些植物的抗氧化能力相比，款冬總黃酮具有很強的體外抗氧化活性，可作為良好的天然抗氧化物質資源進行進一步的開發(fā)利用。本研究為款冬的綜合開發(fā)利用提供了理論基礎。