李 新,冀 凱,杜世豪,滕 莉,王增陽,劉彥君,齊 棟,范華英

(1.煙臺大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺大學(xué)),山東 煙臺 264005;2.煙臺市煙臺山醫(yī)院藥劑科,山東 煙臺 264000;3.煙臺市毓璜頂醫(yī)院腎內(nèi)科,山東 煙臺 264000)

血栓病是指由于血管內(nèi)形成異常的血栓使得血流受阻造成機(jī)體內(nèi)各種器官供血受阻而引起的各種臟器機(jī)能障礙疾?。ㄐ纬杉铀倭烁鞣N心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展[1]．血小板是人體正常凝血機(jī)制的關(guān)鍵組成部分,是導(dǎo)致心腦血管疾病的重要原因[2]．隨機(jī)臨床薈萃分析結(jié)果表明,抗血小板治療對血栓栓塞性疾病非常有利,并且能夠預(yù)防動脈栓塞和靜脈血栓栓塞等嚴(yán)重的血管病變[3]．目前臨床上使用的抗血小板藥物主要包括阿司匹林、氯吡格雷、阿昔單抗等,雖然這些藥物可以起到一定的抗血小板作用,但是仍會導(dǎo)致較多的不良反應(yīng),包括:出血風(fēng)險(xiǎn)、胃粘膜損傷、造血功能障礙[4]．因此,尋找新的更安全有效副作用低的抗血小板藥物具有重要的臨床意義．

松花粉(Pine pollen)又名松黃,為松科植物馬尾松PinusmassonianaLamb、油松PinustabuliformisCar或同屬數(shù)種植物的干燥花粉[5]．《神農(nóng)本草經(jīng)》里有記載:“松花(粉),氣味甘平無毒,主治心腹寒熱邪氣,利小便,消淤血,久服輕身益氣力,延年”[6]．松花粉所含黃酮類物質(zhì)可有效降低血脂和膽固醇,維持正常血壓[7],所含的各種維生素有利于增加血管壁細(xì)胞的生長,促進(jìn)心臟和大腦的血液微循環(huán)．松花粉中提取的粗多糖、精致多糖和酚類物質(zhì)在體外具有較強(qiáng)的抗氧化能力[8]．然而,松花粉是否具有抗血栓及抗血小板作用是未知的．本研究確定了松花粉對血小板聚集、血栓形成和血液循環(huán)的作用和機(jī)制,從而為松花粉抗血小板和抗血栓作用提供藥理學(xué)支持．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性成年SD(Sprague-Dawley)大鼠(體重220±20 g)72只,購自山東省濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司,實(shí)驗(yàn)動物合格證No.0003609,許可證號:SCXK(魯)2014007．所有實(shí)驗(yàn)用大鼠均在溫度為24±1 ℃和濕度為55%±5%的條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,并給予自由飲食和飲水．本研究經(jīng)過煙臺大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn),且實(shí)驗(yàn)方案符合煙臺大學(xué)動物倫理委員會的規(guī)定．

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

LBY-NJ4血小板聚集儀(北京泰利康信科技有限公司),電子計(jì)重秤(上海浦春儀器有限公司),電子天平(余姚紀(jì)銘稱重設(shè)備有限公司),TGL-16G臺式高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),多功能酶標(biāo)儀(美國 Molecular Devices 公司),MVIS-2035全自動血液流變分析儀(重慶天海醫(yī)療設(shè)備有限公司)．

1.3 藥品與試劑

破壁松花粉由煙臺新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)有限公司提供;阿司匹林來源于美國Sigma公司;0.9%氯化鈉溶液購自山東科倫藥業(yè)有限公司;環(huán)氧合酶-1(Cyclooxygenase-1,COX-1)、環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)、β-actin購自Santa Cruz Biotechnology Inc.(Dallas,Texas,USA);BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;大鼠血栓素B2(Thromboxane B2,TXB2)試劑盒、大鼠6-酮-前列腺素F1α(6-keto prostaglandin F1α,6-keto-PGF1α)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司．

1.4 大鼠急性血瘀模型的制作及指標(biāo)檢測

1.4.1 模型制作 將36只健康雄性成年SD大鼠隨機(jī)分為6組,每組6只.(1)正常對照組:給予等劑量的0.9%氯化鈉溶液灌胃;(2)血瘀模型組:給予等劑量的0.9%氯化鈉溶液灌胃;(3)阿司匹林組:以0.9%氯化鈉溶液為溶媒配制阿司匹林溶液,按照20 mg/kg的給藥劑量通過灌胃給藥;(4)低劑量松花粉組:以0.9%氯化鈉溶液為溶媒配制松花粉溶液,按照0.90 g/kg的給藥劑量通過灌胃給藥;(5)中劑量松花粉組:按照1.80 g/kg的給藥劑量通過灌胃給藥;(6)高劑量松花粉組:按照3.60 g/kg的給藥劑量通過灌胃給藥．所有藥物均為每日單次給藥,連續(xù)給藥14 d．第13天除正常對照組之外其余各組大鼠參照文獻(xiàn)[9]方法制備大鼠急性血瘀模型,即大鼠以0.8 mg/kg的劑量皮下注射腎上腺素,正常對照組大鼠注射等劑量生理鹽水．第一次注射2 h后,除正常對照組外,將其余各組大鼠置于冰水浴中5 min,2 h后再次注射腎上腺素．之后將大鼠放入鼠籠中正常飼養(yǎng)．禁食不禁水12 h后,大鼠末次給藥30 min后腹主動脈取血．

1.4.2 血液流變學(xué)測定 禁食不禁水12 h后,大鼠末次給藥30 min后腹主動脈取血,用肝素抗凝后,檢測血液流變學(xué)指標(biāo):全血粘度包括:高切變率、中切變率和低切變率,血漿粘度,紅細(xì)胞壓積．

1.4.3 體內(nèi)血小板聚集實(shí)驗(yàn) 禁食不禁水12 h后,大鼠末次給藥30 min后腹主動脈取血,用3.8%枸櫞酸鈉抗凝．血液在1 000 r/min下離心6 min,取出上層血漿即為富血小板血漿,余下的部分在3 000 r/min下離心15 min,上層清液即為貧血小板血漿．將血小板數(shù)目調(diào)至4×108個(gè)/mL．用二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate,ADP)誘導(dǎo)血小板聚集,使用血小板聚集儀測定血小板聚集率,最后結(jié)果以最大聚集率表示．

1.5 大鼠動-靜脈旁路血栓形成模型制作及指標(biāo)檢測

1.5.1 模型制作 將36只健康雄性成年SD大鼠隨機(jī)分為6組,每組6只:(1)正常對照組,(2)血栓模型組,(3)阿司匹林組,(4)低劑量松花粉組,(5)中劑量松花粉組,(6)高劑量松花粉組.各組給藥情況與“1.4.1”中對應(yīng)的各組相同,在末次給藥30 min后,參照文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行建立大鼠動-靜脈旁路血栓形成模型．即大鼠麻醉后,仰臥位進(jìn)行固定,分離右側(cè)的頸總動脈和左側(cè)頸外靜脈,在自制的3段聚乙烯管中放入一根已稱重的6 cm的手術(shù)絲線．以0.9%的生理鹽水充滿聚乙烯管,然后將聚乙烯管的一段插入左頸外靜脈,另一端插入右頸總動脈．打開動脈夾,使血流從右頸總動脈流經(jīng)聚乙烯管后,返回左頸外靜脈．開放血流15 min后,取絲線稱濕重,絲線放室溫6 h干燥后,稱重記為干重．血栓質(zhì)量為稱得的總質(zhì)量減去絲線質(zhì)量．血栓形成抑制率的計(jì)算公式如公式(1)所示．正常對照組為假手術(shù)組，只分離動脈和靜脈,不進(jìn)行插管．

血栓形成抑制率=

(1)

1.5.2 TXB2和6-keto-PGF1α的含量測定 待大鼠動-靜脈旁路血栓形成模型制備完成后,大鼠進(jìn)行腹主動脈取血．以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,收集上清,用于檢測TXB2和6-keto-PGF1α的含量．其含量利用ELISA試劑盒檢測,實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行,含量用pg/mL表示．

1.5.3 Western Blot方法檢測松花粉對COX蛋白表達(dá)的影響 將形成血栓處的血管段進(jìn)行組織破碎后加入裂解液(PMSF∶RPMI=1∶100)攪勻后,使用電動勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿,直至成混懸液狀,勻漿過程在冰水浴中進(jìn)行．將制得的組織勻漿置于4 000×g的離心力下離心10 min,取上清液至預(yù)冷的EP管中,即得到血管總蛋白．使用BCA蛋白濃度試劑盒測量蛋白濃度,以30 μg的上樣量求得上樣體積．蛋白上樣于10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電泳完成后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,之后置于5%的脫脂牛奶中進(jìn)行孵育4 h．加入一抗并放在4 ℃過夜,第二天洗滌后加入二抗孵育1.5 h．洗滌后,極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測蛋白條帶,并使用ImageQuant LAS 4000拍照處理．

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 松花粉對大鼠血液流變性的影響

如表1所示,急性血瘀模型組大鼠的全血粘度包括高切變率、中切變率和低切變率以及血漿粘度和紅細(xì)胞壓積均有明顯的增高,具有顯著性差異,表明造模后大鼠血液處于高凝狀態(tài)．不同濃度的松花粉能夠顯著降低大鼠全血粘度、血漿粘度和紅細(xì)胞壓積,且呈劑量依賴性．

表1 松花粉對大鼠血液流變性的影響Tab.1 The effects of Pine pollen on the hemorheological parameters in

與對照組相比,#P<0.05,##P<0.01;與血瘀模型組相比,*P<0.05,**P<0.01.

2.2 松花粉體內(nèi)對血小板聚集的影響

如圖1所示,血瘀模型組的血小板聚集率顯著高于其他各組,與正常對照組相比,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)．松花粉中、高劑量組可以顯著降低血小板聚集率,其中,高劑量松花粉組作用與阿司匹林組作用相當(dāng)．

2.3 松花粉對大鼠動-靜脈旁路血栓形成的影響

通過大鼠動-靜脈旁路血栓模型探究松花粉的抗血栓活性,結(jié)果如圖2所示.與血栓模型組相比,不同濃度的松花粉(0.90,1.80,3.60 g/kg)組的血栓濕重和干重明顯降低,且呈劑量依賴性抑制血栓的形成:血栓濕重形成抑制率分別為10.2%,18.0%,23.1%;血栓干重形成抑制率分別為12.4%,25.4%,37.1%．阿司匹林(20 mg/kg)有較強(qiáng)的抑制作用,血栓形成濕重和干重抑制率分別為27.2%,56.0%．

2.4 松花粉對血漿TXB2和6-keto-PGF1α的含量及TXB2/6-keto-PGF1α的影響

如表2所示,在大鼠動-靜脈血栓模型中,模型組大鼠血漿TXB2,6-keto-PGF1α的含量及TXB2/6-keto-PGF1α比值明顯升高,阿司匹林能夠顯著降低TXB2,6-keto-PGF1α的含量及TXB2/6-keto-PGF1α比值．與模型組相比,不同濃度的松花粉(0.90,1.80,3.60 g/kg)也能夠顯著降低TXB2,6-keto-PGF1α的含量及TXB2/6-keto-PGF1α比值．

2.5 松花粉對COX蛋白表達(dá)的影響

使用Western Blot方法研究了松花粉對COX蛋白表達(dá)的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3、圖4所示.與正常對照組相比,血栓模型組COX-1和COX-2的表達(dá)明顯升高．阿司匹林可以顯著降低COX-1和COX-2的表達(dá),而松花粉能夠通過選擇性地抑制COX-2的表達(dá),而對COX-1的表達(dá)沒有明顯的影響,表明松花粉通過選擇性靶向COX-2發(fā)揮抗血栓的作用．

表2 松花粉對血漿TXB2和6-keto-PGF1α的含量及TXB2/6-keto-PGF1α的影響Tab.2 The effects of Pine pollen on plasma TXB2 and 6-keto-PGF1α levels and the ratio of

與正常對照組相比,##P<0.01;與血栓模型組相比,*P<0.05,**P<0.01.

3 討 論

血栓栓塞性疾病是嚴(yán)重危害公共健康的常見病與多發(fā)病．許多疾病與血小板功能障礙有關(guān)[11]．但是,很多有效的抗血小板藥物在臨床上會產(chǎn)生一些副作用,如胃腸道出血．因此,尋找更加安全有效且副作用低的抗血小板藥物是亟待解決的問題．本研究通過測定松花粉的血液流變學(xué)、抗血小板聚集活性探究其抗血小板及抗血栓作用和作用機(jī)制．

為探究松花粉對微循環(huán)的影響,該研究通過大鼠急性血瘀模型評估血液流變學(xué)參數(shù)．血瘀可導(dǎo)致血小板聚集及血液流變學(xué)異常,血液流變學(xué)異常通常介導(dǎo)許多心腦血管疾病的發(fā)生與發(fā)展[12]．研究結(jié)果顯示,與正常組相比,血瘀模型組全血粘度、血漿粘度、紅細(xì)胞壓積均明顯增加,結(jié)果具有顯著性差異．血小板聚集是決定血液粘度的因素之一[13],通過對血小板的聚集率的測定,結(jié)果證明松花粉具有明顯的抗血小板作用,對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集具有明顯的抑制作用．松花粉在3.60 g/kg劑量時(shí)的抑制作用與阿司匹林20 mg/kg時(shí)的作用相當(dāng)．

該研究通過動-靜脈血栓模型研究了松花粉對血栓形成的影響,結(jié)果表明松花粉具有一定的抗血栓作用．因此,進(jìn)一步探討了松花粉的抗血小板和抗血栓作用的機(jī)制．血栓素A2(Thromboxane A2,TXA2)和前列環(huán)素(Prostacyclin,PGI2)的平衡是影響血小板功能的主要因素[14]．TXA2是血小板生理激動劑,在體內(nèi)極不穩(wěn)定,迅速降解為無活性的TXB2;PGI2是血小板功能抑制劑,在體內(nèi)很快代謝為6-keto-PGF1α．通過ELISA法檢測了動-靜脈血栓模型中TXB2和6-keto-PGF1α的含量,以判斷TXA2和PGI2的含量．COX存在2種不同的亞型:COX-1和COX-2．COX-1在胃腸道中表達(dá)較多,與維持胃腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和功能密切相關(guān)．COX-2的高表達(dá)能夠促進(jìn)單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間粘附,加重炎癥反應(yīng)并通過上調(diào)局部基質(zhì)金屬蛋白酶的活性誘發(fā)血栓形成[15]．因此,通過Western Blot方法檢測了COX-1和COX-2蛋白的表達(dá)．結(jié)果表明阿司匹林能夠顯著降低TXB2的含量,非選擇性抑制COX-1和COX-2的表達(dá)．阿司匹林通過同時(shí)抑制COX-1和COX-2的表達(dá)發(fā)揮抗血小板抗血栓活性,不僅可抑制TXA2的產(chǎn)生,而且抑制PGI2的產(chǎn)生．這種現(xiàn)象稱為“阿司匹林困境”[16]．與阿司匹林相比,松花粉可以選擇性抑制COX-2的表達(dá),降低TXB2的含量以及使TXB2/6-keto-PGF1α的比值趨于平衡．

綜上,本研究結(jié)果表明,松花粉具有較強(qiáng)的抗血小板和抗血栓作用．松花粉選擇性抑制COX-2的表達(dá)并且降低TXB2的含量以及使TXB2/6-keto-PGF1α的比值趨于平衡是其抗血栓作用之一．因此,松花粉在抗血小板和抗血栓治療中可能會有較好的前景．

4 結(jié) 論

本研究證明了松花粉在抗血小板和抗血栓作用中發(fā)揮一定的保護(hù)作用,并且松花粉對COX-2表達(dá)的高度選擇性抑制和使TXB2/6-keto-PGF1α的比值趨于平衡的效果優(yōu)于阿司匹林,為松花粉抗血小板和抗血栓治療提供一定的藥理學(xué)支持．