張建斌 馬儷珍 張 甜 楊 華*

（1 天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津300384 2 天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院 天津300384 3 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷030801）

N-亞硝胺是一類公認(rèn)的毒性化合物，其化學(xué)通式為R1R2N-N=O，廣泛存在于各類食品，尤其是肉制品中，一些揮發(fā)性N-亞硝胺可誘發(fā)細(xì)胞癌變[1-3]，是人類日常飲食安全的重要隱患[4]。食品中N-亞硝胺主要于食品加工和貯藏過(guò)程中形成，常見(jiàn)于腌制、焙烤及原料中等[5-7]。N-亞硝胺不但可以在外界環(huán)境中生成，還可以在人和動(dòng)物的胃中形成[8]。檢測(cè)N-亞硝胺的含量對(duì)于食品安全的監(jiān)管和控制至關(guān)重要。

目前熟肉制品中N-亞硝胺物質(zhì)的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[9]、液相色譜法[10]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-熱能分析法等[11-13]。N-亞硝胺在食品中含量較低，不易富集，前處理過(guò)程中稍有不慎就會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成很大的影響；同時(shí)N-亞硝胺種類多，理化性質(zhì)差異較大，同步檢測(cè)的樣品預(yù)處理方法不一定適用于多種N-亞硝胺。對(duì)傳統(tǒng)腌制食品中N-亞硝胺的測(cè)定，國(guó)標(biāo)方法中的前處理方法——水蒸氣蒸餾法操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，且試驗(yàn)過(guò)程中溫度高，易使被測(cè)物質(zhì)N-亞硝胺損失。目前提取和富集N-亞硝胺的方法采用較多的有低溫真空蒸餾[14]、水蒸氣蒸餾[15]、固相萃取[16]等。超聲提取設(shè)備簡(jiǎn)單、操作容易、條件便于控制等優(yōu)點(diǎn)[17]，可用于固相萃取。何淑娟等[18]、楊金川等[19]采用超聲振蕩提取法提取肉制品中的N-亞硝胺，通過(guò)固相萃取柱凈化后，樣品回收率在85%～98%和82.64%～98.24%。王秀元等[20]用超聲振蕩提取法提取腌制水產(chǎn)品中的N-亞硝胺后，采用活性炭柱凈化，其對(duì)N-亞硝胺的回收率達(dá)到87%。楊寧等[21]采用氧化鋁和C18 混合固相萃取小柱對(duì)腌菜中9 種N-亞硝胺凈化，回收率在75.7%～116.1%。

為了建立快速、有效測(cè)定肉制品中N-亞硝胺的方法，本研究建立了UE-SPE-GC-NPD 和UESPE-HPLC-UV 測(cè)定肉制品中常見(jiàn)的N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-二乙基亞硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-甲乙基亞硝胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-二丙基亞硝胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidin，NPIP）、N-二丁基亞硝胺（N-nitrosodibutylamine，NDBA）、N-亞硝基嗎啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）、N-二苯基亞硝胺（N-nitrosodiphenylamine，NDpheA）9 種揮發(fā)性N-亞硝胺的方法。采用超聲振蕩提取法結(jié)合固相萃取柱凈化對(duì)樣品進(jìn)行前處理，優(yōu)選超聲波萃取條件和固相萃取柱的種類，為選擇快速、簡(jiǎn)便，試劑消耗量少，精密度、準(zhǔn)確度高的樣品前處理方法，提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

魚(yú)肉類油炸制品，購(gòu)于當(dāng)?shù)爻小?/p>

N-亞硝胺混標(biāo)（2 mg/mL）含有NDMA、NDEA、NMEA、NDBA、NDPA、NPIP、NPYR、NMOR、NDPheA 9 種亞硝胺，美國(guó)Sigma 公司；甲醇、乙腈、二氯甲烷（色譜純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水，自制。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1200 高效液相色譜，美國(guó)Agilent 公司；色譜柱VenusilRMP C18，博納艾捷爾科技有限公司；真空抽濾裝置，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Supelco 固相萃取裝置，北京康林科技有限責(zé)任公司；HC-C18 固相萃取小柱、中性氧化鋁（Alumina-N）萃取小柱、椰子殼活性炭萃取小柱（Coconut Charcoal），上海安譜實(shí)驗(yàn)室；K-D 濃縮儀，天津盛淼科技有限公司；GM-0.33A 隔膜真空泵，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；STARTER 3100 pH 計(jì)，上海奧豪斯儀器有限公司；UVS-1漩渦振蕩器，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 9 種N-亞硝胺混標(biāo)用100%甲醇配制成40 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10 mL，置棕色瓶中于-20 ℃避光保存。將儲(chǔ)備液稀釋10 倍，配制成4 μg/mL 的N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液，置棕色瓶中，于冰箱4 ℃冷藏保存。

1.3.2 樣品前處理方法 用粉碎機(jī)將樣品粉碎，稱取肉樣品20.0 g，置于50 mL 具塞離心管中，加入一定體積的二氯甲烷，于振蕩器上渦旋1 min，保持溫度在30 ℃以下，采用超聲波提取一段時(shí)間，低溫條件下離心5 min，傾出有機(jī)相溶劑。同樣方法重復(fù)提取2 次，合并有機(jī)溶劑相，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水，于K-D 濃縮儀濃縮至5 mL，通過(guò)固相萃取技術(shù)凈化萃取樣品，用氮吹儀濃縮至近干，定容1.0 mL，用高效液相色譜儀檢測(cè)樣品中N-亞硝胺的含量。

1.3.3 高效液相色譜的檢測(cè)條件 高效液相色譜的檢測(cè)條件：采用VenusilRMP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，進(jìn)樣量20 μL，柱溫25 ℃，UV檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm，乙腈-水為流動(dòng)相，采用梯度洗脫，洗脫方法見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Table1 The gradient elution method of mobile phase

1.3.4 超聲波提取條件優(yōu)化 稱取20 g 肉樣品，在樣品中加入1 mL 9 種N-亞硝胺混標(biāo)（質(zhì)量濃度為1 μg/mL），以二氯甲烷為提取試劑，采用超聲波提取法優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件。

1.3.4.1 超聲波提取時(shí)間的選擇 固定二氯甲烷的體積為30 mL，提取功率為400 W，設(shè)定萃取時(shí)間分別為10，20，30，40 min 和50 min，研究萃取時(shí)間對(duì)9 種N-亞硝胺提取的影響。

1.3.4.2 超聲波提取二氯甲烷體積的選擇 固定超聲萃取時(shí)間為20 min，超聲提取功率為400 W，設(shè)定二氯甲烷體積分別為20，30，40 mL 和50 mL，研究二氯甲烷體積對(duì)9 種N-亞硝胺提取的影響。

1.3.4.3 超聲波萃取功率的選擇 固定超聲波萃取時(shí)間為20 min，二氯甲烷的體積為40 mL，設(shè)定超聲波功率分別為200，300，400 W 和500 W，研究超聲波功率對(duì)9 種N-亞硝胺萃取的影響。

1.3.5 固相萃取柱的選擇 將質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的9 種N-亞硝胺混標(biāo)分別通過(guò)C18 柱、中性氧化鋁柱和椰子殼活性炭柱3 種固相萃取小柱，然后用高效液相色譜儀檢測(cè)標(biāo)品，計(jì)算回收率。根據(jù)色譜圖的出峰效果和回收率選擇固相萃取小柱的種類。

固相萃?。⊿PE ）的萃取步驟：

1）活化 將6 mL 二氯甲烷以流速1 mL/min緩慢加入萃取小柱中。

2）平衡 用6 mL 甲醇以1 mL/min 的流速通過(guò)固相萃取小柱，再用6 mL 超純水以1 mL/min的流速通過(guò)。

3）上樣 平衡后立即將混合標(biāo)品或超聲波萃取的樣品轉(zhuǎn)移至固相萃取小柱，保持1 mL/min緩慢流出，保持固相萃取柱不被抽干。

4）洗脫 用真空泵將固相萃取柱負(fù)壓抽干，取20 mL 色譜級(jí)甲醇作為洗脫劑，回收固相萃取小柱所吸附的N-亞硝胺，控制負(fù)壓使甲醇以1 mL/min 流速洗脫。

1.3.6 UE-HPLC-UV 的回收率及精密度試驗(yàn) 根據(jù)1.3.4 節(jié)和1.3.5 節(jié)的研究結(jié)果，超聲波提取的條件為：肉樣20 g（分別加標(biāo)的質(zhì)量濃度為1，2 μg/mL 和4 μg/mL），加二氯甲烷提取試劑30 mL，超聲波功率400 W，時(shí)間20 min。按此條件重復(fù)萃取2 次，將萃取液合并后，經(jīng)K-D 濃縮儀濃縮至5 mL，過(guò)椰子殼活性炭小柱，用甲醇洗脫固相萃取柱，收集所有洗脫液，用氮吹儀濃縮至近干，定容1.0 mL，過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜，裝入樣品瓶，用高效液相色譜儀測(cè)定。根據(jù)結(jié)果分析加標(biāo)樣品的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.7 UE-GC-NPD 的回收率及精密度試驗(yàn) 前處理方法同1.3.6 節(jié)，最終將樣品瓶?jī)?nèi)的樣品上氣相色譜儀測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1 軟件包（St Paul，MN）中線性模型（Linear Model）程序進(jìn)行方差分析，采用Tukey HSD 程序進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波萃取時(shí)間對(duì)9 種N-亞硝胺萃取的影響

超聲波萃取時(shí)間對(duì)9 種N-亞硝胺萃取的影響見(jiàn)圖1所示。縱坐標(biāo)表示9 種N-亞硝胺在色譜圖上的峰面積之和。峰面積值越高，所檢測(cè)的N-亞硝胺含量越高。在其它試驗(yàn)相同條件下（二氯甲烷體積30 mL，超聲波萃取功率400 W），萃取時(shí)間10～50 min 范圍，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，峰面積值呈先上升后下降的趨勢(shì)。在萃取時(shí)間10～20 min，峰面積呈直線上升；萃取時(shí)間25 min 時(shí)，峰面積達(dá)到最高值（2 817.67），與萃取20 min 時(shí)的峰面積值（2 807.56）比較，兩者差異不顯著（P＞0.05）。萃取25 min 后，峰面積迅速下降。分析其原因，可能是萃取在帶蓋的離心管中進(jìn)行，蓋的密封性不是很好，萃取超過(guò)25 min 后會(huì)出現(xiàn)N-亞硝胺揮發(fā)損失的現(xiàn)象。綜合考慮后，選取20 min 作為最佳萃取時(shí)間。

圖1 不同超聲波提取時(shí)間對(duì)9 種N-亞硝胺萃取的影響Fig.1 Effect of different extraction time on 9 kinds of N-nitrosamines

2.2 超聲波萃取試劑的體積對(duì)9 種N-亞硝胺萃取的影響

選擇二氯甲烷作為萃取試劑，有機(jī)溶劑的用量影響樣品中N-亞硝胺的萃取效果。圖2顯示二氯甲烷體積對(duì)9 種N-亞硝胺萃取的影響，試驗(yàn)結(jié)果仍以9 種N-亞硝胺在色譜圖中的總峰面積值作為考察指標(biāo)。在其它試驗(yàn)條件（超聲波萃取時(shí)間20 min，超聲波萃取功率400 W）相同的條件下，二氯甲烷用量在20～60 mL 范圍，隨著二氯甲烷用量的增加，9 種N-亞硝胺的總峰面積值整體呈明顯的上升趨勢(shì)。當(dāng)二氯甲烷體積為20～40 mL 時(shí)，二氯甲烷用量與色譜圖對(duì)應(yīng)的總峰面積成正比。比較二氯甲烷體積為40，50，60 mL 時(shí)的總峰面積值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)40 mL 與50 mL 的總峰面積值差異不顯著（P＞0.05），40 mL 與60 mL 的總峰面積值差異不顯著（P＞0.05）。為了節(jié)約有機(jī)試劑，選用40 mL 為最佳萃取體積。

2.3 超聲波萃取功率對(duì)9 種N-亞硝胺提取效果的影響

超聲波萃取功率對(duì)9 種N-亞硝胺提取的影響見(jiàn)圖3?？梢钥闯鲭S著萃取功率（200，300，400W）的增加，9 種N-亞硝胺的總峰面積值顯著增加（P＜0.05）。超聲波萃取的功率越大溫度越高，在使用功率500 W 萃取時(shí)，肉樣品中的許多物質(zhì)更易被萃取出來(lái)，導(dǎo)致樣品萃取液過(guò)于粘稠，不能順利通過(guò)固相萃取小柱凈化。經(jīng)比較，本試驗(yàn)選擇400 W 作為最佳萃取功率。

圖2 二氯甲烷用量對(duì)9 種N-亞硝胺萃取的影響Fig.2 Effect of different methylene chlorides on 9 kinds of N-nitrosamines

圖3 不同超聲波提取功率對(duì)9 種N-亞硝胺提取效果的影響Fig.3 Effect of different ultrasonic extraction power on 9 kinds of N-nitrosamines

2.4 固相萃取柱的選擇

固相萃取柱有許多種，如C18 具有疏水作用，可去除油脂和非極性極強(qiáng)的干擾物。氧化鋁是一類極性很強(qiáng)的吸附填料，性質(zhì)接近硅膠。氧化鋁在高pH 值條件下比硅膠更穩(wěn)定，它通常用于去除芳香族和脂肪族的化合物。

圖4 固相萃取小柱對(duì)9 種N-亞硝胺混標(biāo)的HPLC 色譜圖Fig.4 The HPLC chromatograms of 9 kinds of N-nitrosamines with SPE column

按照固相萃取柱的使用步驟，將質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的9 種N-亞硝胺混標(biāo)分別通過(guò)C18 柱、中性氧化鋁柱和椰子殼活性炭柱3 種固相萃取小柱，用高效液相色譜儀檢測(cè)標(biāo)品，結(jié)果見(jiàn)圖4，分別為標(biāo)品過(guò)固相萃取柱的色譜圖——C18 柱（A）、中性氧化鋁柱（B）和椰子殼活性炭柱（C）。根據(jù)色譜圖中9 種N-亞硝胺的峰面積值對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出3 種固相色譜柱的回收率（見(jiàn)表2）。

由圖4可以看出，與圖4a 和4b 相比，圖4c中的色譜峰最為干凈，說(shuō)明活性炭小柱對(duì)雜質(zhì)的去除效果較好。

從表2可以看出，活性炭柱的回收率最高，達(dá)66.76%～93.20%。在以下試驗(yàn)中選擇椰子殼活性炭柱對(duì)超聲波萃取的樣品進(jìn)行凈化處理。王秀元等[19]、楊金川等[20]、夏曉楠等[22]也采用活性炭萃取小柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，其回收率分別達(dá)到86%～99%，82.64%～98.24%和78.7～118.2%。蔡魯峰等[23]采用高效液相色譜法檢測(cè)肉制品中的9 種N-亞硝胺，采用C18 色譜柱分析，其相關(guān)系數(shù)均大于0.99，方法定量限為0.047～0.097 μg/g；回收率為72.6%～97.6%。

表2 3 種固相萃取小柱凈化效果比較Table2 Comparison of three SPE cartridges used for purification of 9 N-nitrosamines

2.5 UE-SPE-HPLC-UV 方法的回收率及精密度

根據(jù)1.3.4 節(jié)的超聲波萃取條件和1.3.5 節(jié)的固相萃取小柱的選擇結(jié)果，在20 g 肉樣中，分別加質(zhì)量濃度為1，2 μg/mL 和4 μg/mL 的9 種N-亞硝胺的混合標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)超聲波萃取、過(guò)椰子殼活性炭小柱，上機(jī)測(cè)定。加標(biāo)樣品的回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表3。

由表3可以看出，9 種N-亞硝胺的3 組加標(biāo)水平試驗(yàn)回收率值在65.80%～94.20%范圍，其精密度在1.19%～3.42%之間，說(shuō)明UE-SPE-HPLC方法穩(wěn)定，結(jié)果可靠，可以滿足肉制品中痕量N-亞硝胺的測(cè)定。

表3 UE-SPE-HPLC-UV 方法的回收率和精密度Table3 The recovery and sensitivity of the UE-SPE-HPLC-UV

2.6 UE-SPE-GC-NPD 方法的回收率及精密度

由表4可以看出，9 種N-亞硝胺的3 組加標(biāo)水平試驗(yàn)回收率值在66.80%～93.89%范圍，其精密度均在1.39%～3.07%之間，說(shuō)明UE-SPE-GCNPD 方法穩(wěn)定，結(jié)果可靠，可以滿足肉制品中痕量N-亞硝胺的測(cè)定。

表4 UE-SPE-GC-NPD 方法的回收率和精密度Table4 The recovery and sensitivity of the UE-SPE-GC-NPD

3 結(jié)論

本研究建立了一種超聲波萃取、固相萃取凈化結(jié)合高效液相色譜法和氣相色譜法測(cè)定肉制品中9 種N-亞硝胺的分析方法。主要優(yōu)化了超聲波萃取的條件，并明確了固相萃取小柱種類對(duì)9 種N-亞硝胺分離檢測(cè)效果的影響。采用二氯甲烷為提取溶劑，在400 W 的條件下超聲波萃取20 min，對(duì)肉樣品中9 種N-亞硝胺進(jìn)行提取。選取活性炭萃取小柱凈化提取的目標(biāo)物，不僅減少了取樣量，而且縮短了樣品前處理時(shí)間。該前處理方法分別結(jié)合高效液相色譜法和氣相色譜法，較GB/T 5009.26-2003 檢測(cè)N-亞硝胺的方法更簡(jiǎn)單、快速，易于操作，重現(xiàn)性好。UE-SPE-HPLC-UV 法的回收率65.80%～94.20%，其精密度1.19%～3.42%；UE-SPE-GC-NPD 法的回收率66.8%～93.89%，其精密度1.39%～3.07%。這兩種方法的實(shí)際樣應(yīng)用情況良好，適用于肉制品中N-亞硝胺物質(zhì)含量的分析。