韋芬，黃雯，余克服*，廖芝衡，王欣，王英輝

(1. 廣西大學 廣西南海珊瑚礁研究重點實驗室，廣西 南寧 530004；2. 廣西大學 珊瑚礁研究中心，廣西 南寧 530004；3. 廣西大學 海洋學院，廣西 南寧 530004)

1 引言

珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)是地球上生產(chǎn)力和生物多樣性最高的生態(tài)系統(tǒng)之一，為人類生活提供了巨大的經(jīng)濟價值、社會文化價值和生態(tài)服務功能[1]。但近50年來，由于人類活動和全球變暖的影響，多數(shù)珊瑚礁受到不同程度的威脅，且處于不斷退化中[2-4]。珊瑚礁退化的最直觀表現(xiàn)是造礁石珊瑚覆蓋度下降，而造礁石珊瑚作為珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的最主要的構建生物，如何增加造礁石珊瑚的數(shù)量并提高其物種多樣性是修復退化珊瑚礁的關鍵。珊瑚種群數(shù)量的自然補充主要包括有性繁殖和無性繁殖兩種方式，無性繁殖方式是指珊瑚水螅體出芽或分裂增殖，主要表現(xiàn)為珊瑚個體的增長；有性繁殖是通過雌雄配子結合產(chǎn)生新基因型的新生個體[5-6]。有性繁殖方式有兩種，一種是排卵型，一種是排幼型，其中在已研究的造礁石珊瑚中85%為排卵型[7]。相較于無性繁殖，有性繁殖具有繁殖力強、遺傳多樣性高及不損傷母體珊瑚等優(yōu)點[5,8]，因此，有性繁殖對于維持造礁石珊瑚種群數(shù)量、基因多樣性以及維持整個珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和發(fā)展具有更重要的意義。

自20世紀80年代開始，國外學者對石珊瑚的有性繁殖和早期發(fā)育做了大量的記錄和報道，Harrison等[9]1981年和1982年于澳大利亞大堡礁首次揭示了造礁石珊瑚的大規(guī)模繁殖行為，并記錄了多達32種排卵型珊瑚在滿月后幾天內(nèi)同時大量排放精子和卵子的繁殖特性。之后，Babcock等[10]在大堡礁又繼續(xù)觀察，記錄了105種石珊瑚在滿月后的夜晚短時間內(nèi)發(fā)生大規(guī)模的同步排卵行為和多種繁殖類型，并研究了珊瑚幼蟲遷移附著變態(tài)和擴散的特征。Shlesinger等[11]記錄了紅海北部24種造礁石珊瑚的繁殖方式，之后不斷有泰國、肯尼亞、日本、香港、新加坡的珊瑚繁殖方式和早期發(fā)育過程被記錄和報道[12-17]。

我國大陸關于石珊瑚胚胎發(fā)育過程的研究起步較晚，報道也較少。2011年黃潔英等[18-19]第1次報道膨脹薔薇珊瑚（Montipora turgescens）與壯實鹿角珊瑚（Acropora robusta）的胚胎和幼蟲發(fā)育過程，此外，黃潔英[19]還調(diào)查了三亞鹿回頭海域造礁石珊瑚有性繁殖的生物學特性，記錄了該海域的生殖型、配子發(fā)生、繁殖時間等生殖特征。隨后，張詩澤[20]也記錄了該礁區(qū)的芽枝鹿角珊瑚（A.gemmifera）的幼體發(fā)育。張浴陽等[21]在永興島收集了鹿角珊瑚屬（Acropora）的受精卵，人工條件下培育出3 700個幼體。朱潛等[22]于2014年報道了海南文昌云龍灣風信子鹿角珊瑚（A.hyacinthus）的胚胎和幼蟲發(fā)育過程。肖寶華等[23]在實驗室養(yǎng)殖的條件下記錄和報道肉質(zhì)扁腦珊瑚（Platygyra carnosus）的有性繁殖及胚胎發(fā)育過程。

珊瑚有性繁殖中其胚胎和幼蟲的存活及成功附著是進行珊瑚礁生態(tài)修復工作的關鍵環(huán)節(jié)。因此，加強和豐富我國造礁石珊瑚胚胎和幼蟲發(fā)育的認識，可為我國珊瑚礁的生態(tài)修復積累理論依據(jù)。本文于2018年5月對潿洲島造礁石珊瑚的有性繁殖進行調(diào)查與研究，成功記錄了黃廯蜂巢珊瑚（Favia favus）和肉質(zhì)扁腦珊瑚（P. carnosus）胚胎和幼蟲的早期發(fā)育過程。黃廯蜂巢珊瑚是潿洲島蜂巢屬的優(yōu)勢珊瑚種類，重要值百分比為3.16%，是印度-太平洋礁區(qū)的廣布種[24-25]，最早為1979年Rinkevich和Loya[26]在紅海亞喀巴灣記錄其有性繁殖工作，之后陸續(xù)在紅海其他地方、大堡礁、日本、泰國都有報道[13,16,26-28]，但國內(nèi)未見詳細描述；肉質(zhì)扁腦珊瑚的有性繁殖國外未見詳細報道，國內(nèi)肖寶華等[23]2017年曾仔細報道過其發(fā)育過程。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

作者于2018年5月2日在廣西北海潿洲島火山口巖壁下海域采集黃廯蜂巢珊瑚親本（6株）和肉質(zhì)扁腦珊瑚（8株）（在采集前截取一小塊珊瑚斷面，通過卵子顏色判斷其性腺是否發(fā)育成熟）。珊瑚個體直徑均在10 cm以上，整株采集（盡量不要破壞珊瑚的完整性），然后在整理箱中放置足夠多的海水，把珊瑚運回養(yǎng)殖基地。采集的珊瑚樣本經(jīng)形態(tài)學鑒定，確認為黃廯蜂巢珊瑚和肉質(zhì)扁腦珊瑚（圖1）。

2.2 實驗方法

運回的珊瑚迅速放置于潿洲島上實驗基地的養(yǎng)殖缸內(nèi)，養(yǎng)殖用水為過濾的天然海水，系統(tǒng)內(nèi)循環(huán)，自然光照，輔以增氧機和氣石進行補氧，所有使用的容器和工具等都用高錳酸鉀進行消毒。溫度控制在(26±1)℃，鹽度32，每2天換一次海水，每天喂一次少量鹵蟲。每天18:00-24:00密切觀察珊瑚是否出現(xiàn)排卵現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)排卵后用顯微鏡觀察是否受精，若受精率大于10%則把胚胎收集起來，并轉(zhuǎn)移至塑料小白桶（約10 L），胚胎發(fā)育過程所用的海水用100目篩絹再次進行過濾，用增氧機微弱充氧，每天換1/2的海水，受精后0～12 h每隔1 h用奧林巴斯SZX7顯微鏡觀察珊瑚受精卵的胚胎發(fā)育情況，12～24 h每隔2 h進行觀察，24～72 h每隔4 h觀察，72 h之后每隔12 h后再觀察。卵母細胞直徑在顯微鏡下測量。4.5 h后統(tǒng)計排卵量和受精率（有研究表明排卵后2 h內(nèi)受精率最高，之后開始下降，4.5 h后幾乎不再受精[29]，本研究的情況亦如此），具體方法如下：在取樣統(tǒng)計珊瑚卵子數(shù)量前，在桶里加入定量的海水（2 L），并緩慢地不規(guī)則攪動桶內(nèi)的海水，使珊瑚卵子分布均勻，然后采取水樣10 mL，記錄水體內(nèi)珊瑚卵子和受精卵的數(shù)量（卵子出現(xiàn)分裂即為受精），重復采水3次。珊瑚排卵成功后，及時將母體重新放回珊瑚礁區(qū)中。

圖1 采集的珊瑚樣本Fig. 1 Coral samples collected

3 結果

3.1 黃廯蜂巢珊瑚和肉質(zhì)扁腦珊瑚的有性繁殖過程

黃廯蜂巢珊瑚（6株）采集回來暫養(yǎng)3 d后，2018年5月5日（滿月后5 d，農(nóng)歷三月二十）19:20前后觀察到3株珊瑚出現(xiàn)排卵現(xiàn)象，可見帶狀的白色卵包從口盤處排出到水面（圖2），卵包到水面約20 min散開，整個排卵時間約為45 min，卵子呈淡黃色、淡紅色及淡青色，圓形，成熟卵直徑為320 μm。黃廯蜂巢珊瑚的排卵活動一共持續(xù)4 d（5月5日至5月8日）（7日新增1株產(chǎn)卵），都在晚上19:20前后進行。第一天排卵量最多，后面2 d依次減少，到第4天時水面上只有零星的幾顆卵子（第3天和第4天卵子都不受精）。整個排卵期間的排卵量約為1.2×105個，受精率約為20%。

肉質(zhì)扁腦珊瑚（2株）于2018年5月7日（滿月后7 d）22:40前后出現(xiàn)排卵現(xiàn)象，排卵時間為30 min左右，但是未觀察到卵子出現(xiàn)分裂，表明未受精成功。5月8日22:00新增1株珊瑚排卵，此次卵子成功受精，受精率為40%。卵呈粉紅色，圓形或橢圓形，卵子直徑約為400 μm。2 d排卵期總共的排卵量為0.45×104個。

3.2 黃廯蜂巢珊瑚的早期發(fā)育過程

當受精卵開始分裂時，將其收集轉(zhuǎn)移到塑料白桶里，海水溫度控制在（26±1）℃，增氧機充氧。共經(jīng)歷了60 h的胚胎和幼蟲發(fā)育過程，主要有幾個發(fā)育階段：受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、浮浪幼蟲期，胚胎發(fā)育時期具體情況如表1和圖3所示。卵母細胞沒有蟲黃藻（圖3a），受精2 h，細胞開始二分裂。分裂時期包括：2細胞期、4細胞期、8細胞期、16細胞期、32細胞期、桑葚胚期（64細胞期、128細胞期）（圖3b至圖3h），5 h內(nèi)基本完成了卵裂階段，但也有大部分受精卵不發(fā)育或發(fā)育畸形。6 h開始進入囊胚期，黃廯蜂巢珊瑚的囊胚屬于存在囊胚腔的坐墊狀囊胚（圖3i），但是未觀察到坐墊狀；8 h內(nèi)基本停止分裂，胚胎表面變成平滑（圖3j）。進入原腸胚階段后，出現(xiàn)胚孔，隨著發(fā)育的進行，胚孔內(nèi)陷形成原口，完成原腸胚階段（圖3k, 圖3l），沒有觀察到兩個胚孔存在的情況。26 h開始進入浮浪幼蟲時期，早期浮浪幼蟲在顯微鏡下明顯觀察到外面有一層透明的囊，并不停地轉(zhuǎn)圈游動（圖3m）；中期之后幼蟲變?yōu)閳A柱形，兩個胚層明顯（圖3n）；后期透明囊逐漸消失，緊貼內(nèi)胚層（圖3o）；末期看到有一個口盤（原口），四處游動，尋找附著的基質(zhì)（圖3p）。在浮浪幼蟲發(fā)育之前，觀察到很多受精的畸形卵以及正在降解的未受精卵細胞。

3.3 肉質(zhì)扁腦珊瑚的早期發(fā)育過程

肉質(zhì)扁腦珊瑚共經(jīng)歷了約72 h的胚胎和幼蟲發(fā)育過程，主要發(fā)育階段與黃廯蜂巢珊瑚一致。具體情況如表1和圖4所示。

卵母細胞無蟲黃藻（圖4a）。受精2 h后細胞開始分裂，但也有大部分細胞未分裂，表明未受精成功，受精率僅為40%。7 h內(nèi)完成了卵裂階段（圖4b至圖4h），比黃廯蜂巢珊瑚發(fā)育速度稍慢。肉質(zhì)扁腦珊瑚也是保留有囊胚腔的坐墊狀囊胚（圖4i, 圖4j），但也未觀察到坐墊狀，10 h后停止分裂。進入原腸階段后，胚胎內(nèi)陷形成兩個胚孔，之后兩個胚孔逐漸融合成一個胚孔，原腸胚晚期，胚孔慢慢閉合形成原口（圖4k,圖4l）。36 h后進入浮浪幼蟲階段，早期階段幼蟲會漫無目的地輕輕游動（圖4m）；到了中期之后，幼蟲呈梨形或橢圓形，并且能夠伸縮變形，四處游動（圖4n1，圖4n2）；到了晚期，浮浪幼蟲出現(xiàn)腸系膜，胚層分化明顯，游動能力加強（圖4o）。未觀察到浮浪幼蟲末期原口出現(xiàn)的階段，完成此時期可能仍需12 h，即整個幼蟲的完成過程約需72 h。

圖2 正在排卵的黃廯蜂巢珊瑚和收集的卵子Fig. 2 The spawning F. favus and collected oocytes

表1 黃廯蜂巢珊瑚和肉質(zhì)扁腦珊瑚的早期發(fā)育過程Table 1 The early development of F.favus and P.carnosus

4 討論

4.1 廣西潿洲島造礁石珊瑚的排卵行為

在此次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)黃廯蜂巢珊瑚和肉質(zhì)扁腦珊瑚都屬于雌雄同體，行體外受精，產(chǎn)卵時間在滿月后5～8 d，日落之后1～4 h。受水溫、月相等多種因素的影響，不同地方同一種珊瑚的產(chǎn)卵時間也各不相同，如黃廯蜂巢珊瑚在大堡礁蜥蜴島（Lizard Island）產(chǎn)卵時間是12月中旬[27]，日本天草群島是7月中旬到8月[13]，泰國是2-4月[16]，雖然時間不一樣，但是記錄的海水表面溫度（Sea Surface Temperature, SST）都是25℃以上，且均在滿月之后。肉質(zhì)扁腦珊瑚在國外未被詳細報道過，國內(nèi)黃潔英[19]2011年曾記錄肉質(zhì)扁腦珊瑚在三亞鹿回頭海域懷卵時間為4月26日和27日，肖寶華等[23]報道采自廣東徐聞珊瑚礁海域的肉質(zhì)扁腦珊瑚至室內(nèi)人工暫養(yǎng)于5月12-14日（月圓后9～11 d，農(nóng)歷三月二十四至二十六）產(chǎn)卵，表明華南沿岸珊瑚礁區(qū)的肉質(zhì)扁腦珊瑚排卵時間的同一性。此外，我們發(fā)現(xiàn)三亞鹿回頭、廣東徐聞、潿洲島3個地方記錄的水溫均為26℃左右，由此可知，水溫是影響珊瑚產(chǎn)卵的一個重要因素。另外，我們還發(fā)現(xiàn)了2種鹿角珊瑚（Acroporasp.）和1種角蜂巢珊瑚（Favitessp.）產(chǎn)卵，稀杯盔形珊瑚（Galaxea astreata）和盾形陀螺珊瑚（Turbinaria peltata）懷卵。1984-2015年間潿洲島海域最低月平均SST的平均值是20.67℃，多出現(xiàn)在1-2月；最高月平均SST的平均值是29.79℃，主要出現(xiàn)在7-8月；潿洲島海域年平均SST的平均值為25.71℃，月平均SST從4月開始逐漸上升至25℃[25]，5月下旬又有西南浪的干擾。很多研究表明造礁石珊瑚的受精和早期發(fā)育的理想溫度是25～28℃[30-31]，所以潿洲島造礁石珊瑚大規(guī)模產(chǎn)卵的時間極有可能是4月中旬到5月中旬，在該時段潿洲島海域海水溫度適宜，并且海況相對穩(wěn)定。由于我們?nèi)狈ψ匀缓^(qū)珊瑚排卵現(xiàn)象的調(diào)查，因此今后將在此時間段內(nèi)對該海區(qū)的珊瑚排卵行為開展進一步的野外研究。

圖3 黃廯蜂巢珊瑚的早期發(fā)育過程Fig. 3 The early development of F. favus

4.2 黃廯蜂巢珊瑚和肉質(zhì)扁腦珊瑚胚胎及幼蟲的發(fā)育特點

在觀察中我們發(fā)現(xiàn)黃廯蜂巢珊瑚和肉質(zhì)扁腦珊瑚的卵母細胞最大直徑分別為320 μm和400 μm。有研究曾報道大堡礁和紅海北部黃廯蜂巢珊瑚卵母細胞的最大直徑分別為360 μm和395 μm[11,27]；肉質(zhì)扁腦珊瑚卵母細胞大小未見報道，其他扁腦珊瑚卵母細胞最大直徑在329.1～395 μm不等[11,17,32-33]。種內(nèi)之間卵母細胞大小的不同，一個原因是由于地理上差異造成，另一個可能是技術上的不同獲得的數(shù)據(jù)也略有差異，如組織切片方法測量與直接測量方法[11]。因此，如果要比較不同地方的同種珊瑚卵母細胞的大小，則應該標準化組織切片方法和測量的依據(jù)；而不同珊瑚卵母細胞的大小不一，與產(chǎn)卵數(shù)量、杯口大小等都有關系，且三者之間的關系較為復雜，還有待進一步研究[11]。

在排卵型珊瑚里，25%的浮浪幼蟲從母體獲得蟲黃藻，75%的幼蟲需要后天從環(huán)境中獲取蟲黃藻[7]，且研究發(fā)現(xiàn)與珊瑚母體共生的蟲黃藻在產(chǎn)卵前5～7 d通過濾泡細胞進入卵母細胞中[34]。本研究中黃廯蜂巢珊瑚和肉質(zhì)扁腦珊瑚的卵母細胞都不含蟲黃藻，表明這兩種珊瑚的蟲黃藻不來源于母體，一般造礁石珊瑚后天獲取蟲黃藻的時間為浮浪幼蟲附著后4～5 d[7]。Shlesinge和Loya[28]報道黃廯蜂巢珊瑚產(chǎn)卵后26～30 d才在杯口發(fā)現(xiàn)蟲黃藻，而扁腦珊瑚（P.lamellina）則是16～18 d，由于本研究只調(diào)查到浮浪幼蟲時期，故未觀察到蟲黃藻的出現(xiàn)。

圖4 肉質(zhì)扁腦珊瑚的早期發(fā)育過程Fig. 4 The early development of P.carnosus

黃廯蜂巢珊瑚和肉質(zhì)扁腦珊瑚的胚胎發(fā)育開始時都是均等分裂，進入16細胞期后分裂開始出現(xiàn)不規(guī)則，都經(jīng)過卵裂期、囊胚期、原腸胚期以及浮浪幼蟲期，與腔腸動物珊瑚綱生物的胚胎早期發(fā)育過程吻合，肉質(zhì)扁腦珊瑚發(fā)育速度稍慢于黃廯蜂巢珊瑚。由于這2種珊瑚都屬于堅實型珊瑚，因此進入囊胚階段后，形態(tài)為扁平的仍留有囊胚腔的坐墊狀囊胚[33]。但是在此次發(fā)育過程中未觀察到坐墊狀囊胚，有可能是發(fā)育時間過快錯過了觀察時間。另外，黃廯蜂巢珊瑚未觀察到兩個胚孔同時出現(xiàn)的情況，而肉質(zhì)扁腦珊瑚在原腸胚早期觀察到兩個胚孔，然后進一步擴大發(fā)育融合成一個胚孔。本文觀察到的肉質(zhì)扁腦珊瑚胚胎的發(fā)育過程大部分與肖寶華等[23]觀察到的結果一致，但是我們未觀察到假胚孔的出現(xiàn)、坐墊狀囊胚，另外，整個胚胎發(fā)育的時間也比其觀測到的快12 h左右，由于記錄的溫度一致，因此具體原因還有待研究。

此外，我們發(fā)現(xiàn)此次黃廯蜂巢珊瑚和肉質(zhì)扁腦珊瑚受精率都較低（20%與40%），肖寶華等[23]報道肉質(zhì)扁腦珊瑚的受精率為75%，尖邊扁腦珊瑚的受精率大于73%[17]。造成差異的主要原因可能是精子濃度過低。在實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)，肉質(zhì)扁腦珊瑚第1天產(chǎn)卵未受精，第2天增加1株珊瑚產(chǎn)卵則發(fā)生受精現(xiàn)象，而且有研究表明，珊瑚高受精率（大于70%）的精子濃度需104～107個/mL[17]。另外，這2種珊瑚在發(fā)育過程中不斷有胚胎畸形和死亡，而且形成浮浪幼蟲的胚胎很少，未能觀察到浮浪幼蟲附著變態(tài)的階段。造礁石珊瑚在附著前的胚胎與幼蟲的高死亡率以及幼蟲附著后的高死亡率一直是珊瑚有性繁殖的瓶頸[35]。而此過程中的水質(zhì)條件、水流、光照、溫度、沉積物等都是影響珊瑚胚胎和幼蟲發(fā)育的關鍵因素[5-6,36-37]，但具體的內(nèi)在機制還不清楚。因此詳細地了解和掌握珊瑚有性繁殖過程中的生物學特性有助于發(fā)現(xiàn)珊瑚胚胎和幼體高死亡率的癥結所在，也是利用有性生殖手段進行珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)修復過程中最重要的一個環(huán)節(jié)。

5 結語

通過2018年對潿洲島海域2種造礁石珊瑚有性繁殖行為的研究，推測該海域珊瑚產(chǎn)卵的時間約在4月中旬至5月中旬之間。黃廯蜂巢珊瑚于2018年5月5日開始排卵，連續(xù)進行4 d，成熟的卵子直徑為320 μm；肉質(zhì)扁腦珊瑚連續(xù)2 d（5月7日和8日）產(chǎn)卵，卵子大小為400 μm。本研究中2種珊瑚的胚胎和幼蟲的發(fā)育過程均為：受精卵-卵裂階段-囊胚階段-原腸胚階段-浮浪幼蟲，但未觀察到浮浪幼蟲附著變態(tài)的階段。同時研究還發(fā)現(xiàn)，2種珊瑚的卵子都沒有共生蟲黃藻，需要后天從環(huán)境中獲得。本研究為首次記錄廣西潿洲島造礁石珊瑚的有性繁殖行為，為今后利用有性繁殖來進行珊瑚的生態(tài)修復提供了理論基礎。