李海濤，何靜，姜重臣，陳志云，周鵬

(1. 自然資源部南海環(huán)境監(jiān)測中心，廣東 廣州 510300；2. 中國科學(xué)院南海海洋研究所 熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510301)

1 引言

工業(yè)革命以來二氧化碳大量排放導(dǎo)致的全球變暖和海洋酸化，已經(jīng)對(duì)全球海洋生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生了深刻影響[1-3]。無論是鈣化生物還是非鈣化生物，全球變暖和海洋酸化均會(huì)對(duì)其造成一系列影響，如影響基因表達(dá)、繁殖力、幼體成活率等[4-6]。此外，全球變暖和海洋酸化還會(huì)影響物種的分布、生物群落的多樣性和結(jié)構(gòu)[7]。

有殼翼足類（Thecosome Pteropods）是海洋浮游動(dòng)物的重要類群，在海洋食物鏈中扮演著十分關(guān)鍵的角色，它們不僅是重要的初級(jí)消費(fèi)者，也是其他海洋生物和海鳥的餌料[8-9]。有殼翼足類的外殼主要由文石構(gòu)成[10]，相比方解石，文石更易溶解于海水中[11]。因此，有殼翼足類被廣泛用作海洋酸化監(jiān)測的指示物種[6, 12]。

準(zhǔn)確的物種鑒定是開展海洋酸化等環(huán)境變化對(duì)翼足類影響研究的前提，因?yàn)椴煌奈锓N會(huì)對(duì)環(huán)境變化產(chǎn)生不一樣的響應(yīng)[13]。然而，我國對(duì)翼足類的分類學(xué)研究仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。張福綏[14]在半個(gè)多世紀(jì)前較為系統(tǒng)地開展了中國海浮游軟體動(dòng)物（包括翼足類、異足類和海蝸牛）的分類學(xué)研究，此后國內(nèi)的分類結(jié)論[15]基本沿用了其觀點(diǎn)，鮮有其他關(guān)于浮游軟體動(dòng)物的分類報(bào)道。國外學(xué)者[16-17]提出一些新的翼足類分類系統(tǒng)尚未被國內(nèi)采用，許多分類錯(cuò)誤也沒得到訂正，如張福綏[14]對(duì)強(qiáng)卷螺屬（Agadina）、厚唇螺（Diacriatrispinosa）和蛆狀螺（Cuvierinacolumnella）等種類的鑒定有誤[18-20]。DNA條形碼技術(shù)[21]的出現(xiàn)為物種鑒定提供了新的手段，該技術(shù)能有效回避鑒定者對(duì)生物個(gè)體形態(tài)差異的主觀認(rèn)識(shí)和判斷。近年來，DNA條形碼技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于翼足類的分類學(xué)、種類鑒定和地理群體的遺傳分化等方面的研究[13,22-23]。

龜螺屬（Cavolinia）和小龜螺屬（Diacavolinia）是翼足類龜螺科（Cavoliniidae）龜螺亞科（Cavoliniinae）下的2個(gè)屬。目前，我國只采用了前1個(gè)屬，將后1個(gè)屬的種類均歸入到前者之中。有殼翼足類的分類主要是根據(jù)貝殼的形態(tài)特征，但由于其貝殼形態(tài)較為簡單，因而難以進(jìn)行準(zhǔn)確的物種鑒定[22]。龜螺屬和小龜螺屬的分類極為混亂，被人為建立了大量的亞種和變形[24-25]。比如，長期以來小龜螺屬被認(rèn)為僅有長吻小龜螺（D. longirostris）1 個(gè)種[26-27]，后來 van der Spoel等[25]根據(jù)細(xì)微的形態(tài)差異將這1個(gè)種分出22個(gè)種及4個(gè)變形。但通過對(duì)比COI序列，分布于東北大西洋的小龜螺屬4個(gè)形態(tài)種被證明為同一物種[28]。因此，龜螺屬和小龜螺屬的種及種以下分類單元的有效性尚需通過分子手段來加以證實(shí)。本研究分析了西北太平洋和印度洋的龜螺屬和小龜螺屬種類的形態(tài)特征，同時(shí)結(jié)合線粒體COI和16S基因序列對(duì)其進(jìn)行物種鑒定，以期解決兩屬部分種類的分類混亂和爭議，并揭示其地理遺傳分化。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

樣品于2016年至2018年采自西北太平洋（含南海）及印度洋海域的12個(gè)站位（圖1）。使用大型浮游生物網(wǎng)采用垂直拖網(wǎng)和水平拖網(wǎng)相結(jié)合的方式采集浮游動(dòng)物樣品，絕大部分樣品為夜間用水平拖網(wǎng)的方式采集。海上采集的浮游動(dòng)物樣品經(jīng)篩絹過濾后用無水酒精固定（酒精使用量約為浮游動(dòng)物體積的3～4倍），冰凍保存帶回實(shí)驗(yàn)室。體視鏡下對(duì)目標(biāo)種類進(jìn)行分選和初步的分類鑒定，并編號(hào)拍照。共計(jì)43個(gè)標(biāo)本用于DNA序列的分析（表1）。

2.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測序

取部分或整只動(dòng)物，采用堿裂解法[29]提取DNA。使用引物L(fēng)CO-1490(5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′)和 HCO-2198 (5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′)[30]擴(kuò)增COI基因片段；使用16sar-L(5′-CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3′)和 16sbr-H(5′-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3′)[31]擴(kuò)增 16S rRNA基因片段。

圖1 采樣站點(diǎn)分布Fig. 1 Distribution of sampling sites

表1 樣品采集信息和基因庫（GenBank）登錄號(hào)Table 1 Collection information and GenBank accession numbers for specimens analyzed in this study

PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL，包括：2×擴(kuò)增緩沖溶液25 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside Triphosphate，dNTP）400 μmol/L，引物各0.3 μmol/L，高保真 PCR 酶（TOYOBO，KOD FX）1.0 U，模板DNA 1 μL，加去離子水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 預(yù)變性 2 min；98℃ 變性 15 s，53℃ 退火 30 s，68℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)；最后68℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司廣州分公司進(jìn)行回收純化和測序，COI基因片段進(jìn)行雙向測序，16S rRNA基因片段進(jìn)行反向引物測序（個(gè)別樣品為雙向測序），測序引物與擴(kuò)增引物相同。

2.3 系統(tǒng)學(xué)分析

拼接、校對(duì)后的測序結(jié)果，首先利用美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的BLAST程序（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列同源性檢索，并將COI基因序列在綜合性序列分析工具軟件DAMBE 5[32]中翻譯成氨基酸序列，以確保測序獲得的序列不是線粒體假基因（Nuclear Mitochondrial Pseudogenes）。本文測序獲得的序列連同基因庫（GenBank）中下載的其他序列，使用DAMBE 5內(nèi)置的Clustal W程序進(jìn)行多重序列比對(duì)。使用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA 7.0[33]計(jì)算堿基的組成，基于Kimura 雙參數(shù)（Kimura 2-Parameter，K2P）模型計(jì)算遺傳距離，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，可靠性經(jīng)過1 000次自展（Bootstrap）檢驗(yàn)。采用進(jìn)化樹分析軟件MrBayes 3.2[34]構(gòu)建貝葉斯樹（Bayesian Inference，BI），分子進(jìn)化模型使用核苷酸替換DNA進(jìn)化最優(yōu)模型分析軟件jModelTest 2.1[35]根據(jù)貝葉斯信息準(zhǔn)則（Bayesian Information Criteria）標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算得出。COI和16S rRNA基因的最佳進(jìn)化模型分別為HKY+I+G和HKY+G。在馬爾可夫鏈蒙特卡羅（Markov Chain Monte Carlo）參數(shù)下運(yùn)行 300 萬代，每100代抽樣一次，前2 500代作為老化樣本舍去。BI樹各分支置信度以后驗(yàn)概率表示。使用進(jìn)化樹作圖軟件FigTree 1.4.3顯示BI樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖。

3 結(jié)果

3.1 形態(tài)特征

在西北太平洋和印度洋海域共采集到4個(gè)龜螺屬種類，分別為鉤龜螺（C. uncinata）（圖2a至圖2c)、駝龜螺（C. gibbosa）（圖 2d）、球龜螺（C. globulosa）（圖 2e）和寬彎龜螺（C. labiata）（圖 2f）。其中，鉤龜螺的貝殼形態(tài)呈連續(xù)的變化，小個(gè)體的側(cè)棘（側(cè)突起）顯得更為發(fā)達(dá)，尾棘向背方彎曲的程度也更大（圖2a），腹殼接近圓形（圖2a至圖2b）；大個(gè)體的側(cè)棘不明顯，尾棘彎曲程度較?。▓D2c）。

圖2 龜螺屬種類的貝殼形態(tài)（比例尺為5 mm）Fig. 2 Shell morphology of Cavolinia species (scale bars: 5 mm)

小龜螺屬具有極其豐富的形態(tài)多樣性（圖3a，圖3c，圖 3e，圖 3g，圖 3i至圖 3l），其側(cè)突起尖銳（圖 3a，圖 3c）或極發(fā)達(dá)（圖 3i）或不明顯（圖 3j至圖 3l），背殼前緣部分凹陷（圖3e，圖3i至圖3k）或不凹陷（圖3g，圖3l）。參照文獻(xiàn)[25]進(jìn)行形態(tài)鑒定，部分個(gè)體可明確鑒定為D. grayi（圖 3a，圖 3b）、D. vanutrechti（圖 3c，圖 3d）、D. pacifica（圖 3e，圖 3f）、D. elegans（圖 3g，圖 3h）和D. angulosa（圖 3j，圖 3k，圖 4）等形態(tài)種。部分個(gè)體難以進(jìn)行形態(tài)種的劃分，如圖3i所示的標(biāo)本與D. flexipes（圖4）的側(cè)突起一樣發(fā)達(dá)，但前者背殼前緣部分遠(yuǎn)不及后者寬大。圖3l所示的標(biāo)本，雖然其側(cè)突起不及圖3c的發(fā)達(dá)，但其形態(tài)特征與D. vanutrechti的正模標(biāo)本（圖4）十分相似，故將其也定為D. vanutrechti。

3.2 序列分析

測序共獲得23條COI序列（GenBank登錄號(hào)MK913370～MK913392）和20條16S rRNA基因序列（GenBank 登錄號(hào) MK913393～MK913412）。本文共計(jì)擴(kuò)增了近30個(gè)小龜螺屬標(biāo)本的COI基因，擴(kuò)增并測序成功的12條序列，經(jīng)BLAST比對(duì)和序列分析后發(fā)現(xiàn)，僅有1個(gè)標(biāo)本（圖3l）的序列與GenBank中的同種（形態(tài)種）具有較高的同源性。其余11條序列與龜螺屬和小龜螺屬種類的同源性很低，且存在一段3 bp的插入/缺失片段，我們推測這些序列為線粒體假基因（序列未提交GenBank）。這些線粒體假基因均能正確翻譯為氨基酸序列，沒有產(chǎn)生終止密碼子，且核苷酸變異位點(diǎn)大多數(shù)（75.5%）為密碼子第三位堿基。

真正的線粒體COI序列長658 bp，A、T、G、C平均含量分別為24.3%、40.7%、18.0%和17.0%。線粒體假基因序列長655 bp，A、T、G、C平均含量分別為23.3%、38.3%、20.1%和18.3%。16S rRNA基因序列長 369～372 bp，存在 5個(gè)插入/缺失位點(diǎn)，A、T、G、C平均含量分別為30.7%、30.9%、21.5%和17.0%。所有序列的A+T的含量均明顯高于G+C的含量。

3.3 系統(tǒng)發(fā)育和遺傳距離

線粒體COI和16S rRNA基因的BI樹和NJ樹有大體一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，本文只顯示BI樹或NJ樹（圖4，圖5）。在16S rRNA基因系統(tǒng)樹中，分布于西北太平洋的小龜螺屬D. grayi、D. vanutrechti、D. pacifica、D.elegans、D. angulosa等形態(tài)種聚為一個(gè)分支，并獲得很高的支持率（圖4）。因此，這些不同的形態(tài)種可能屬于同一物種，即長吻小龜螺（D. longirostris）。

圖3 不同形態(tài)類型的小龜螺Fig. 3 Different morphotypes of Diacavolinia

圖4 基于16S rRNA基因構(gòu)建的小龜螺和其他腹足類鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Neighbor-joining phylogenetic tree of genus Diacavolinia and other gastropods based on mitochondrial 16S rRNA gene sequences

COI基因系統(tǒng)分析結(jié)果表明，鉤龜螺、球龜螺和長吻小龜螺在系統(tǒng)樹中均形成2個(gè)地理支系并獲得100%的支持率，且3個(gè)種類都分別形成大西洋和印度洋-西北太平洋地理支系（圖5）。其余種類則在COI系統(tǒng)樹中形成單系群。

COI基因的K2P遺傳距離分析表明，種內(nèi)/支系內(nèi)的遺傳距離在0～0.025之間，平均值為0.009；種間/支系間的遺傳距離則在0.082～0.393之間，平均值為0.232；鉤龜螺、球龜螺和長吻小龜螺3個(gè)形態(tài)種不同支系間的遺傳距離則在0.102～0.246之間，平均值為0.137。16S rRNA基因的K2P遺傳距離分析表明，除1條D. angulosa（GenBank登錄號(hào) MK913410）與其余序列遺傳距離較大外（0.039～0.053，平均值0.044），其余 19 條序列（包括D. grayi、D. vanutrechti、D. pacifica、D. elegans、D. angulosa等形態(tài)種）的遺傳距離在0～0.033之間，平均值為0.012。小龜螺屬與數(shù)據(jù)庫中唯一的1條翼足類16S rRNA基因序列（Clione limacine，AJ223406）的遺傳距離在0.400以上。

4 討論

本文對(duì)西北太平洋小龜螺屬標(biāo)本16S rRNA基因序列的分析結(jié)果表明，D. grayi、D. vanutrechti、D. pacifica、D. elegans、D. angulosa等形態(tài)種可能為同1個(gè)種。Maas等[28]的研究結(jié)果也表明，東北大西洋小龜螺屬的4個(gè)形態(tài)種實(shí)為1種。因此，van der Spoel等[25]基于形態(tài)差異對(duì)小龜螺屬物種的劃分無法得到DNA數(shù)據(jù)的支持，可能過高估計(jì)了該屬的物種多樣性。側(cè)突起的發(fā)達(dá)程度，背殼前緣的凹陷程度這些連續(xù)變異的數(shù)量性狀顯然無法作為種類區(qū)分的依據(jù)。小龜螺屬的種類多樣性和分類學(xué)問題，尚需通過更大范圍的采樣并結(jié)合多方面的證據(jù)來解決。當(dāng)前，將小龜螺屬作為單型屬處理更妥，即僅包含長吻小龜螺一個(gè)種。

圖5 基于COI基因構(gòu)建的龜螺屬和小龜螺屬貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Bayesian inference phylogenetic tree of genera Cavolinia and Diacavolinia based on mitochondrial COI gene sequences

寬彎龜螺在我國被作為C. inflexa的變種來處理[14]，前者與后者存在明顯的形態(tài)差異[36]，且系統(tǒng)學(xué)分析也支持前者為獨(dú)立種。鉤龜螺被分為2個(gè)亞種（圖5手繪圖），亞種之下又被分為5個(gè)變形[24]。這種精細(xì)的劃分為種類鑒定和其他研究帶來極大的混亂。物種具有形態(tài)可塑性，棲息環(huán)境可能影響其形態(tài)特征，不同發(fā)育階段的個(gè)體往往也具有一定的差異。我們獲得的不同大小的鉤龜螺存在一定的形態(tài)差異（圖2a至圖2c），如小個(gè)體側(cè)棘的發(fā)達(dá)程度和尾棘的彎曲程度更大。尤其是我們獲得的最大標(biāo)本（圖2c），殼寬可達(dá)10 mm，明顯大于張福綏[14]和van der Spoel[24]所記錄的標(biāo)本（小于6.5 mm）。

開放的海洋環(huán)境沒有限制物種分布的地理障礙，終生浮游生物或是其他海洋生物的階段性浮游幼體也有較強(qiáng)的擴(kuò)散能力，因而許多物種被認(rèn)為分布廣泛。然而，一些所謂的環(huán)球或環(huán)極地分布的物種（形態(tài)種）實(shí)際上是一些局限性分布的隱存種，形態(tài)種生物多樣性無法反映真實(shí)的物種多樣性[37-39]。鉤龜螺、球龜螺和長吻小龜螺在COI系統(tǒng)樹中均形成明顯的地理支系，產(chǎn)生了明顯的地理遺傳分化，不同支系間的K2P遺傳距離都大于3%的閾值[21]，其內(nèi)部可能存在隱存種。

線粒體基因在物種鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。然而，線粒體假基因的存在為上述研究造成了一定程度的干擾。線粒體假基因通常極易被通用引物擴(kuò)增出來，甚至是優(yōu)先被擴(kuò)增出來[40]。本文擴(kuò)增得到真正線粒體COI基因序列的比例極低，這提醒我們?cè)陂_展DNA條形碼研究的時(shí)候應(yīng)防范線粒體假基因的干擾，否則會(huì)得出錯(cuò)誤的結(jié)論。

致謝：中國科學(xué)院南海海洋研究所周林濱博士采集了印度洋樣品，李開枝研究員在實(shí)驗(yàn)過程中給予了幫助和支持，謹(jǐn)致謝忱。