李洪娟，陳剛*，郭志雄，王維政，黃建盛*，曾澤乾

(1. 廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088)

1 引言

魚類的生命活動易受到各種環(huán)境因子的影響，水體溶解氧含量是其中重要的影響因子之一[1]。溶解氧作為維持水生動物生存的基本條件，它主要影響水生動物的生長、呼吸、物質(zhì)和能量代謝等各種生理生化指標(biāo)[2-4]。在自然因素和人為因素的影響下，近岸海域缺氧現(xiàn)象呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢，造成水體周期性和連續(xù)性低氧的現(xiàn)象，且部分近岸海域在夏、秋季大多處在低氧狀態(tài)（溶解氧含量大約為3 mg/L），從而導(dǎo)致了大量魚類和海洋無脊椎動物的死亡，成為名副其實的“死水區(qū)”[5-8]。水生動物在低氧環(huán)境下，容易引起機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，尤其是低氧脅迫后的復(fù)氧階段更加劇了應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷，產(chǎn)生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS），最終影響其生理功能[9]。為了降低ROS對機(jī)體的損傷，生物體通過抗氧化酶體系來發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。同時，低氧會導(dǎo)致有氧代謝降低和無氧代謝增加，隨之能量代謝系統(tǒng)也會受到影響[10-11]。近年來研究表明，魚類通過增加呼吸效率、增加血氧親和力、改變代謝效率以及降低能量消耗等方式來應(yīng)對低氧環(huán)境[9]。因此，研究低氧脅迫下魚類的氧化應(yīng)激水平及其能量利用不僅為魚類適應(yīng)低氧環(huán)境提供參考依據(jù)，還可以探討其在水產(chǎn)健康養(yǎng)殖中的意義。

軍曹魚（Rachycentron canadum）亦稱海鱺、海龍魚，隸屬于鱸形目（Perciformes）、軍曹魚科（Rachycentridae）、軍曹魚屬（Rachycentron），為海產(chǎn)名貴魚類，是南方沿海海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的重要組成部分，且對水體溶氧要求很高，一旦缺氧，將造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[12-13]。近年來，由于風(fēng)和潮汐的作用，受水溫、季節(jié)、養(yǎng)殖密度等因素的影響，在軍曹魚養(yǎng)殖海區(qū)經(jīng)常出現(xiàn)低氧現(xiàn)象。溶解氧的變化會引起機(jī)體氧化應(yīng)激水平的改變，肝臟是機(jī)體對外界刺激反應(yīng)最早、最敏感的組織之一，也是最早出現(xiàn)損傷的組織，嚴(yán)重時則會使魚類肝臟的解毒功能處于超負(fù)荷狀態(tài)[14]。同時，魚類為了延長自身的生存時間，會降低其運(yùn)動能力，因此肝臟和肌肉組織的代謝情況也備受關(guān)注[15]。本實驗室已研究了急性低氧對軍曹魚大規(guī)格幼魚血液生化指標(biāo)的影響[16]，而關(guān)于低氧及復(fù)氧對其氧化應(yīng)激水平的影響尚未開展研究。為此，本實驗以軍曹魚幼魚為對象，研究低氧脅迫與復(fù)氧對其肝臟和肌肉組織氧化應(yīng)激水平與能量利用的影響，探討軍曹魚對低氧環(huán)境的適應(yīng)性，以期為軍曹魚的健康養(yǎng)殖提供參考資料。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

實驗魚來源于廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院魚類種子工程與養(yǎng)殖團(tuán)隊在東海島生物研究基地繁育的幼魚，隨機(jī)選取健康、活力好的個體200尾用專用魚苗運(yùn)輸車運(yùn)回實驗室，幼魚的體質(zhì)量為（220.67±20.73）g，全長為（29.37±3.76）cm。實驗在自制的室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行，水體交換量為90 L/h，水槽的長、寬、高分別為70 cm、50 cm和60 cm，每個水槽放20尾幼魚。暫養(yǎng)期間，通過調(diào)節(jié)水槽內(nèi)的充氣量大小，保持水中溶解氧在6 mg/L以上，水溫為（26.3±2.5）℃，鹽度為 27.8±0.47，總氨氮含量為（0.17±0.03）mg/L。每日投喂石斑魚專用配合飼料2次（廣東越群海洋生物研究開發(fā)有限公司），及時清理糞便。實驗開始前一天停止投食。

2.2 實驗設(shè)計

實驗在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的6個水槽中進(jìn)行，分為實驗組和對照組，各3個重復(fù)。對照組采用循環(huán)水養(yǎng)殖并始終保持持續(xù)充氣及流水狀態(tài)，用溶氧儀（臺灣衡欣，AZ8403）每隔10 min監(jiān)測溶氧量的變化，對照組的溶氧量為（6.64±0.35）mg/L；實驗組通過調(diào)節(jié)循環(huán)水的流量、關(guān)閉充氣及水槽上方覆蓋薄膜的方法來降低水體溶解量，并用溶氧儀實時監(jiān)測。當(dāng)溶解氧為（2.64±0.25）mg/L條件下低氧脅迫維持3 h，取樣后，立即恢復(fù)常氧狀態(tài)，復(fù)氧后溶氧量為（6.34±0.15）mg/L，在復(fù)氧8 h，24 h和48 h后取樣，實驗組和對照組取樣時間一致。

2.3 樣品采集與制備

實驗處理后，實驗組在低氧脅迫與常氧恢復(fù)的各個時間點取樣，常氧對照組在實驗結(jié)束后取樣，每個時間點每桶各取3尾魚，將實驗魚用適量的200 mg/L間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222）海水溶液快速麻醉，用紗布擦干解剖，取其肌肉和肝臟組織，放置于1.50 mL凍存管中，迅速放于液氮中速凍，之后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱，保存待測。取肝臟和肌肉各0.60 g，按1∶9加入0.90%生理鹽水，在冰水浴中用勻漿機(jī)（IKA）勻漿5 min，制成10%勻漿液；之后在溫度4℃、轉(zhuǎn)速2 000 r/min的條件下，離心15 min；取上清液分裝后，置于-80℃保存，用于各酶活指標(biāo)的測定。

2.4 酶活力測定

采用南京建成生物工程研究所檢測試劑盒測定組織中氧化應(yīng)激和能量利用指標(biāo)，包括丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、脂質(zhì)過氧化物（Lipid Peroxide，LPO）、谷胱甘肽還原酶（Glutathione Reductase，GR）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPx）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）以及乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）和糖原。MDA采用硫代巴比妥酸（TBA）法，反應(yīng)體系產(chǎn)生紅色產(chǎn)物，在532 nm波長處測其吸光度，計算轉(zhuǎn)換為MDA含量；GR采用紫外比色法，定義1 g組織蛋白1 min使反應(yīng)體系中底物還原型輔酶Ⅱ（Triphosphopyridine Nucleotide，NADPH）的濃度改變1 mmol/L所需的酶量為一個酶活力單位；CAT采用鉬酸銨法，定義1 mg組織蛋白1 s分解1 μmol的H2O2的量為一個活力單位；GPx采用比色法，定義1 mg蛋白質(zhì)，1 min扣除非酶反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中谷胱甘肽（Glutathione，GSH）濃度降低1 μmol/L為一個酶活力單位；SOD采用羥胺法，定義1 mg組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率50%時所對應(yīng)的SOD量為一個活力單位（單位U）；蛋白質(zhì)濃度測定采用考馬斯亮藍(lán)法；LDH采用微板法，定義1 g組織蛋白37℃與基質(zhì)作用15 min，反應(yīng)體系中產(chǎn)生1 μmol丙酮酸為1單位；糖原采用比色法，利用糖原在濃硫酸的作用下可脫水生成糖醛衍生物，后者再與蒽酮作用形成藍(lán)色化合物，與同法處理的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液比色定量。相應(yīng)的操作步驟參照試劑盒說明書。

2.5 數(shù)據(jù)處理

實驗所得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用配對t檢驗方法分析對照組和低氧脅迫后的數(shù)據(jù)差異顯著性，以p＜0.05表示差異顯著，以p＜0.01表示差異極顯著；采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析對照組與恢復(fù)常氧不同時間點的數(shù)據(jù)差異顯著性，并用Duncan檢驗進(jìn)行多重比較。

3 結(jié)果

3.1 低氧脅迫對軍曹魚幼魚氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

低氧脅迫對軍曹魚幼魚肝臟和肌肉的氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響見圖1。由圖1可知，低氧脅迫3 h后，肝臟MDA含量與對照組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.675，df=2，p=0.022＜0.05），肌肉 MDA 含量與對照組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.352，df=2，p=0.049＜0.05）（圖 1a）；肝臟LPO活性與對照組無顯著性差異（p＞0.05），肌肉LPO活性比對照組降低了0.08 μmol/g，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.482，df=2，p=0.037＜0.05）（圖 1b）；肝臟CAT活性比對照組降低了4.81 U/mg，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.715，df=2，p=0.013＜0.05），肌肉 CAT 活性與對照組無顯著性差異（p＞0.05）（圖 1c）；肝臟和肌肉GPx 活性均與對照組無顯著性差異（p＞0.05）（圖 1d）；肝臟SOD活性與對照組無顯著性差異（p＞0.05），而肌肉SOD活性與對照組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.027，df=2，p=0.037＜0.05）（圖 1e）；肝臟 GR 活性與對照組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.428，df=2，p=0.047＜0.05），肌肉 GR 活性與對照組無顯著性差異（p＞0.05）（圖 1f）。

3.2 低氧脅迫對軍曹魚幼魚能量利用指標(biāo)的影響

低氧脅迫對軍曹魚幼魚肝臟和肌肉的能量利用指標(biāo)的影響見圖2。由圖2可知，低氧脅迫3 h后，肝臟LDH活性比對照組升高了169.80 U/g，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.816，df=2，p=0.020＜0.05），肌肉 LDH 活性比對照組升高了177.90 U/g，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.845，df=2，p=0.031＜0.05）（圖 2a）；肝糖原含量比對照組降低了8.51 mg/g，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=22.14，df=2，p=0.002＜0.01），肌糖原含量比對照組降低了 1.41 mg/g，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.13，df=2，p=0.006＜0.01）（圖 2b）。

3.3 復(fù)氧過程對軍曹魚幼魚氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

圖1 低氧脅迫對軍曹魚幼魚肝臟和肌肉氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Fig. 1 Effects of hypoxic stress on oxidative stress indicator of liver and muscle of juvenile cobia

圖2 低氧脅迫對軍曹魚幼魚肝臟和肌肉的乳酸脫氫酶活性、糖原含量的影響Fig. 2 Effects of hypoxia stress on lactate dehydrogenase activity and glycogen content in liver and muscle of juvenile cobia

表1 復(fù)氧過程對軍曹魚幼魚肝臟和肌肉氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Table 1 Effects of reoxygenation on oxidative stress indicator of liver and muscle of juvenile cobia

復(fù)氧過程對軍曹魚幼魚肝臟和肌肉氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響見表1。由表1結(jié)果顯示，肝臟組織中，MDA含量恢復(fù)常氧8 h后與對照組無顯著差異（p＞0.05），24 h和48 h后顯著高于對照組（p＜0.05）；LPO活性在復(fù)氧 8 h、24 h和 48 h后顯著高于對照組（p＜0.05）；在復(fù)氧8 h、24 h和48 h過程中，CAT活性顯著高于對照組（p＜0.05），并且在24 h時CAT活性達(dá)到最大；復(fù)氧8 h、24 h和48 h后，GPx活性顯著高于對照組（p＜0.05），呈逐步增加趨勢，且在復(fù)氧24 h后達(dá)到最大值；在復(fù)氧8 h和24 h的過程中，SOD含量逐漸升高，且在復(fù)氧24 h后顯著高于對照組（p＜0.05）；在復(fù)氧8 h、24 h和48 h過程中GR活性顯著高于對照組（p＜0.05）。肌肉組織中，MDA含量在復(fù)氧8 h和24 h后顯著高于對照組（p＜0.05），且逐漸升高，48 h 與對照組無顯著性差異；LPO活性在復(fù)氧8 h、24 h和48 h后顯著高于對照組（p＜0.05），且在復(fù)氧8 h時達(dá)到最大值，隨后逐漸降低；CAT活性在復(fù)氧24 h后顯著高于對照組（p＜0.05）；GPx活性在復(fù)氧 8 h、24 h和 48 h后顯著高于對照組（p＜0.05），呈逐步下降趨勢，但未能降低到正常水平；SOD活性在復(fù)氧8 h、24 h和48 h后顯著高于對照組（p＜0.05）；GR活性在復(fù)氧8 h和24 h后顯著高于對照組（p＜0.05），且在復(fù)氧 24 h后，GR 活性達(dá)到最大值，復(fù)氧24～48 h階段GR活性逐漸下降，在復(fù)氧48 h后無顯著性差異。

3.4 復(fù)氧過程對軍曹魚幼魚能量利用指標(biāo)的影響

復(fù)氧過程對軍曹魚幼魚肝臟和肌肉能量利用指標(biāo)的影響見表2。表2結(jié)果顯示，肝臟組織中，LDH活性在復(fù)氧8 h、24 h和48 h后，與對照組無顯著性差異（p＞0.05），隨著復(fù)氧時間的增加活性逐步降低，且恢復(fù)到正常水平；肝糖原含量在恢復(fù)氧氣24 h后顯著高于對照組（p＜0.05），復(fù)氧48 h后顯著低于對照組（p＜0.05）。肌肉組織中，LDH 活性在復(fù)氧 8 h、24 h和48 h后無顯著性差異（p＞0.05）；肌糖原含量在復(fù)氧8 h、24 h和 48 h 后顯著低于對照組（p＜0.05）。

4 討論

正常狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)的ROS處于一種不斷產(chǎn)生又不斷被清除的動態(tài)平衡狀態(tài)，而過多的ROS便會對機(jī)體造成一定的毒害，如MDA和LPO含量的變化。機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)作為ROS的清除系統(tǒng)，主要包括SOD、CAT、GPx和GR，參與ROS的清除以及在機(jī)體的保護(hù)性防御反應(yīng)中發(fā)揮巨大作用[1]。糖原是機(jī)體內(nèi)最為重要的功能物質(zhì)，對維持機(jī)體的能量代謝有重要作用。因此，實驗將從以下3個方面進(jìn)行討論。

表2 復(fù)氧過程對軍曹魚幼魚肝臟和肌肉能量利用指標(biāo)的影響Table 2 Effects of reoxygenation on energy utilization indicator of liver and muscle of juvenile cobia

4.1 低氧脅迫與恢復(fù)對軍曹魚組織MDA和LPO含量的影響

機(jī)體受到低氧脅迫后，體內(nèi)的ROS含量發(fā)生變化，從而引起機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的變化[17]。MDA和LPO作為脂質(zhì)過氧化的一種指標(biāo)，其含量增加表明低氧脅迫對魚體產(chǎn)生了氧化損傷，影響魚類的生理功能[18]。本實驗中，在低氧脅迫3 h后，肝臟和肌肉中MDA含量顯著降低，肌肉LPO含量也顯著降低，這是因為在低氧脅迫下軍曹魚供氧受到限制，使氧氣經(jīng)過線粒體呼吸鏈相應(yīng)減少，那么線粒體產(chǎn)生的ROS也相應(yīng)減少，這與對瓦氏黃顙魚（Pelteobagrus vachelli）的研究結(jié)果相似[1]。肝臟MDA含量在復(fù)氧24 h和48 h后顯著升高，且肌肉MDA含量在復(fù)氧8 h和24 h后顯著升高；肝臟和肌肉LPO活性在復(fù)氧8 h、24 h和48 h后均出現(xiàn)不同程度的升高，說明恢復(fù)溶氧后軍曹魚氧化應(yīng)激反應(yīng)較為強(qiáng)烈。這與對瓦氏黃顙魚和花鱸（Lateolabrax maculatus）的研究結(jié)果相似[1,9]。分析其原因可能由于軍曹魚在復(fù)氧過程中由于大量氧氣的導(dǎo)入，機(jī)體補(bǔ)償代謝更加劇了氧化應(yīng)激脅迫，使得ROS的濃度迅速升高，導(dǎo)致生物大分子過氧化，如LPO和MDA含量升高，因而出現(xiàn)了復(fù)氧過程中更為強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激現(xiàn)象。

4.2 低氧脅迫與恢復(fù)對軍曹魚組織抗氧化酶活性的影響

低氧能夠影響魚體抗氧化防護(hù)能力，從而引起魚類產(chǎn)生氧化應(yīng)激，其與抗氧化酶活性密切相關(guān)[19]。酶類抗氧化劑（如CAT、SOD、GPx和GR）可清除細(xì)胞內(nèi)多余的氧自由基，來預(yù)防氧化應(yīng)激對組織或細(xì)胞的損傷，從而維持機(jī)體的ROS平衡[20]。本研究中，肝臟和肌肉中GPx活力在低氧脅迫3 h后無顯著性差異，而肝臟CAT和GR活力顯著降低，肌肉SOD活力顯著升高，這與對細(xì)鱗肥脂鯉（Piaractus mesopotamicus）和葛氏鱸塘鱧（Perccottus glenii）的研究結(jié)果相似[21-22]。說明低氧脅迫3 h時，機(jī)體抗氧化酶體系未被完全激活，機(jī)體線粒體仍然可以在靜止?fàn)顟B(tài)下呼吸，在一定程度上抵抗低氧脅迫或產(chǎn)生較少的ROS或存在代謝減痕作用，導(dǎo)致線粒體有氧呼吸減弱，減少了電子傳遞鏈上電子逃逸的幾率，以致氧攜帶電子減少，從而減少了ROS的生成，主要的原因可能是低氧脅迫下魚類的耐受性較高，且低氧脅迫的時間較短[23]。在復(fù)氧8 h、24 h和48 h階段，肝臟和肌肉中CAT、SOD、GPx和GR活性均出現(xiàn)不同程度的升高。肝臟CAT、SOD和GPx活性在復(fù)氧24 h后達(dá)到最大值，而在復(fù)氧24～48 h階段，其活性逐漸下降，但未能恢復(fù)到正常水平；在復(fù)氧過程中，肌肉SOD和GPx活力沒能恢復(fù)到正常水平，這與花鱸和鯔魚（Mugil cephalus）的研究結(jié)果相似，恢復(fù)溶氧后其氧化應(yīng)激反應(yīng)仍然較為強(qiáng)烈[9,14]，說明在缺氧后再復(fù)氧的過程中，ROS在組織或細(xì)胞內(nèi)快速蓄積，過量的ROS造成魚體氧化應(yīng)激和抗氧化體系的紊亂，從而使軍曹魚體內(nèi)的抗氧化防御機(jī)制在缺氧后再復(fù)氧的過程中被完全激活。綜上所述，魚類在低氧脅迫下氧化應(yīng)激參數(shù)變化各異，表明機(jī)體能夠提高自身的抗氧化潛能，從而為解決再氧化后體內(nèi)的氧化應(yīng)激做好準(zhǔn)備[1]。本研究中氧化損傷指標(biāo)（MDA和LPO）和能量利用指標(biāo)（LDH和糖原）也證實了這一結(jié)論。

4.3 低氧脅迫與恢復(fù)對軍曹魚能量利用的影響

機(jī)體正常生命活動的運(yùn)行需要能量來維持。糖原是機(jī)體內(nèi)最為重要的供能物質(zhì)，對維持機(jī)體的能量代謝有重要作用[24]。而LDH可以催化丙酮酸和乳酸之間的相互轉(zhuǎn)化，為生命活動提供能量，是魚類機(jī)體無氧代謝的標(biāo)志酶，其活力大小在一定程度上反映了無氧代謝能力的高低[25]。

本實驗中，在急性低氧脅迫3 h后，肝臟和肌肉中糖原含量急劇下降，LDH含量急劇上升，表明機(jī)體由于氧氣不足進(jìn)行了無氧代謝，動用糖原中貯存的能源物質(zhì)來維持其基本代謝，同時LDH活力升高，將更多的丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，乳酸濃度升高表示厭氧糖酵解反應(yīng)加劇，以應(yīng)對突然出現(xiàn)的低氧環(huán)境[14,26]，與對白鰱（Hypophthalmichthys molitrix）和卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）的研究結(jié)果一致[24,27]。復(fù)氧過程中，肝臟和肌肉LDH含量呈現(xiàn)相反的變化趨勢，但在復(fù)氧48 h后，其LDH含量均與對照組無顯著性差異；肌糖原含量顯著降低。這說明盡管機(jī)體的代謝水平隨著復(fù)氧時間的增加而逐漸恢復(fù)，但仍需部分厭氧糖酵解產(chǎn)生ATP為機(jī)體供能，這與大彈涂魚（Boleophthalmus boddaerti）和梭魚（Liza haematocheila）的研究結(jié)果相似[28-29]。已有研究顯示，魚類的白肌組織是乳酸產(chǎn)生和清除的主要部位[30]，本實驗說明軍曹魚肌肉具備一定的厭氧代謝能力，可以通過厭氧代謝提供能量，從而使LDH和糖原含量維持在一定的范圍內(nèi)，有利于減少肝臟等重要器官的損傷，也有利于提高軍曹魚適應(yīng)低氧環(huán)境的能力。

5 結(jié)論

低氧脅迫與恢復(fù)對軍曹魚機(jī)體的氧化應(yīng)激和能量利用有顯著的影響。在低氧脅迫階段，軍曹魚幼魚抗氧化酶活力存在顯著差異，無氧代謝增加；在復(fù)氧階段，不同組織的抗氧化應(yīng)激能力不同，且肝臟在抗氧化應(yīng)激防御體系中發(fā)揮重大作用。隨著復(fù)氧時間的增加，機(jī)體能量供應(yīng)能夠通過自身的生理調(diào)節(jié)逐漸恢復(fù)到正常水平，說明軍曹魚具有一定的抗逆性。

致謝：感謝廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院2017級曹勤、曹丹煜及2018級鄺杰華、蔡潤佳、黃寶松、毛非凡、鄧文鑫在樣品采集中給予的幫助。