張正雨，田繼遠，于娟,2*，楊桂朋,2，崔煜，陳得萍，高萍，許瑞，陳容

(1. 中國海洋大學 海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室，山東 青島 266100；2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室，山東 青島 266071；3. 青島農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山東 青島 266109；4. 自然資源部第一海洋研究所，山東 青島 266061)

1 引言

胞外酶活性可以指示水環(huán)境中有機物的分布特征以及微生物的營養(yǎng)狀況。Chróst等[4]指出營養(yǎng)鹽對堿性磷酸酶活性有顯著影響，在周圍環(huán)境和細胞內(nèi)可利用的無機磷充足時，磷酸酶在微生物體內(nèi)的合成會受到抑制，只有當可利用的磷酸鹽被消耗達到臨界值，這種抑制才會解除，即“抑制-誘導機制”。胞外酶活性受環(huán)境溫度[5]、pH[6]、重金屬離子、UV-B[7]等條件的影響，且同種因素對不同酶活性的影響也不同。目前水體中胞外酶的研究主要涉及葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、幾丁質(zhì)酶、肽酶、磷酸酶、硫酸酯酶、脂肪酶等，其中對堿性磷酸酶的研究較多[8-10]。國內(nèi)外已對沉積物[10-11]、湖泊河流水[12-13]、海水[8,14]以及大洋環(huán)流[9,15]中的磷酸酶進行了研究。研究表明堿性磷酸酶可作為水體中磷狀況的指示因子[16-18]，而且不同海區(qū)堿性磷酸酶的主要來源不同。姜經(jīng)梅等[11]指出長江口潮灘表層沉積物中堿性磷酸酶活性與降解磷細菌豐度有顯著正相關，洪華生等[8]對廈門西港海域海水的研究指出浮游植物的堿性磷酸酶活力占主導地位。國際上對其他胞外酶也有報道[19-21]，但國內(nèi)研究較少，中國近海海水胞外酶活性的研究大多針對單一胞外酶，且研究區(qū)域限于臺灣海峽[22]、膠州灣[23]、黃海和渤海[24]等海域，對于黃、東海大面積胞外酶活性的分布尚無報道。本研究擴大了胞外酶研究區(qū)域，并探討了其影響因素，有助于進一步了解胞外酶對有機碳的降解作用。

測定胞外酶活性最常用的辦法是熒光模擬底物法[25]（Fluorogenic Model Substrates，F(xiàn)MS）。該方法所用底物通常具有一個人工熒光發(fā)色基團[6,26]，如7-氨基-4-甲基香豆素（7-Amino-4-Methylcoumarin，AMC）、4-甲基傘形酮（4-Methylumbelliferone，MUF）；一個或多個天然小分子基團（葡萄糖、氨基酸等），二者通過肽鍵或者酯鍵相連。在胞外酶的作用下，鍵斷裂釋放出熒光發(fā)色基團從而被熒光分光光度計檢測。

黃、東海東臨太平洋，西接中國大陸，陸架面積占總海域的70%以上，是最具代表性的大陸架淺海。黃、東海有長江、黃河等眾多河流輸入，同時受黃海冷水團、臺灣暖流、沿岸流、黑潮等的影響，加上人為活動的輸入，生態(tài)環(huán)境復雜，具有重要研究價值。膠州灣位于山東半島東南部、黃海西岸。膠州灣及青島沿岸工業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、港口發(fā)達，受人為活動影響較為明顯，近年來隨著海洋經(jīng)濟的發(fā)展，水體富營養(yǎng)化程度日益嚴重。由于同時受陸地、潮流、黃海的影響，環(huán)境復雜。本文選取膠州灣灣口附近海域、黃海海域、東海海域進行研究。運用FMS對2017年春季黃、東海以及2018年春季膠州灣灣口附近海域表層海水中的8種胞外酶（堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AP）、肽酶（Leucine Aminopeptidase，AMP）、脂肪酶（Lipase，LIP）、幾丁質(zhì)酶（Chitinase，CHI）、纖維素酶（Cellulase，CEL）、α-D-葡萄糖苷酶（α-D-Glucosidase，AGLU）、β-D-半乳糖苷酶（β-D-Galactosidase，BGAL）、木糖苷酶（Xylosidase，XYL））活性的水平分布特征進行了研究，并探討了環(huán)境因素對胞外酶活性的影響，對進一步了解中國近海海水中有機物循環(huán)和能量流動具有重要意義。

2 材料與方法

2.1 樣品的采集和保存

分別于2017年3月25日至4月15日、2018年4月28日至29日，隨“東方紅2號”調(diào)查船對黃、東海（26°～36°N，120°～128°E）的 44 個大面站位及膠州灣附近海域（35.8°～36.2°N，120.0°～121.2°E）的 10 個站位表層海水進行采樣并測定胞外酶活性（圖1），研究其水平分布。

2017年航次由北向南布設 A、B、C、D、FJ、F、P、E、S、T 10個斷面，其中B、C斷面位于黃海冷水團，長江口區(qū)域包括D、FJ、F、P 4個斷面。黃海與東海的分界線為長江口北岸啟東角與朝鮮半島南側濟州島西南角之間的連線，本次調(diào)查將D斷面視為黃海與東海之間的分界（D斷面不計入黃海、東海酶活性平均值的計算）。

現(xiàn)場海水采用12 L采水器（Niskin Rosette）進行采樣?，F(xiàn)場溫度、鹽度、水深由CTD（Sea-Bird 911 plus）獲得。取250 mL海水樣品用0.22 μm的微孔濾膜過濾后，-20℃冷凍保存，待運回陸地實驗室后盡快測定酶活性。

2.2 胞外酶活性的測定

胞外酶活性測定方法為FMS，所測定的8種胞外酶所對應的底物分別是：4-甲基傘形酮酰磷酸酯（AP）、4-甲基傘形酮油酸酯（LIP）、L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素鹽酸鹽（AMP）、4-甲基傘形酮-β-D-纖維素二糖苷（CEL）、4-甲基傘形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷（AGLU）、4-甲基傘形酮-β-D-吡喃半乳糖苷（BGAL）、4-甲基傘形酮-N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖苷（CHI）、4-甲基傘形酮-β-D-木糖苷（XYL）。實驗所用試劑均購自Sigma公司。

你說說，時為國家電網(wǎng)公司生產(chǎn)技術部主任的鄧永輝會缺錢嗎？肯定不缺！然而，鄧永輝卻以買房缺錢的名義，向北京澤源惠通科技公司老板劉某提出借款300萬元。劉某當然清楚，這是鄧永輝在訛他，明知是個當也得裝憨去上哇，因為他要依靠鄧永輝在國家電網(wǎng)的地位牽線做業(yè)務。因此，劉某先后5次送給鄧永輝362萬元和一套價值34.7萬元的紅木家具。

圖1 2017年春季黃、東海（a）和2018年春季膠州灣附近海域（b）采樣站位Fig. 1 Sampling stations in the Yellow Sea and the East China Sea in spring 2017 (a) and in the Jiaozhou Bay nearby waters in spring 2018 (b)

將底物加入已過濾的海水樣品中使底物最終濃度為2 μmol/L，在現(xiàn)場海水溫度及黑暗條件下進行反應。分別在0 h和2 h取3 mL反應物于石英比色皿中，加入 200 μL CAPS 緩沖溶液（3-環(huán)已胺-1-丙磺酸，pH 10.3），用熒光儀（HITACHI，F(xiàn)-4500）測定其熒光強度。用煮沸20 min的海水作為空白。其中緩沖溶液具有終止反應及增加熒光密度的作用。熒光物質(zhì)的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為365 nm和455 nm（MUF）、380 nm和440 nm（AMC）。在相應酶的作用下，底物被分解并釋放出小分子基團和熒光發(fā)色基團，通過測定熒光發(fā)色團的熒光強度，根據(jù)熒光強度與底物濃度之間的標準曲線，計算胞外酶對底物的水解速率，即胞外酶活性，單位為 pmol/ (L·h)。

酶活性計算公式：v=（F-F0）/（t×k）。式中，v為酶水解底物的速率，單位為pmol/(L·h)；F為反應2 h后的熒光強度；F0為0 h時的熒光強度；k為單位濃度標準熒光物質(zhì)的熒光強度；t為反應時間，單位為h。

2.3 Chl a含量及營養(yǎng)鹽的測定

Chla含量的測定采用Parsons等[27]的測定方法。用90%的丙酮溶液低溫萃取24 h后，F(xiàn)-4500熒光儀測定熒光值。硝酸鹽亞硝酸鹽磷酸鹽的分析方法參照Grasshoff等[28]；氨氮測定方法參照Holmes等[29]，采用全自動間斷化學分析儀（QuAAtro，Seal Analytical）分析，在航次中采集水樣后立即測定。

Chla和營養(yǎng)鹽數(shù)據(jù)來源于本航次的共享數(shù)據(jù)，分別由廈門大學高亞輝老師、中國海洋大學辛宇老師課題組提供。

2.4 數(shù)據(jù)處理

每個樣品的酶活性平行測定3次，取平均值，用數(shù)據(jù)分析軟件Origin 8、ODV 4和IBM SPSS Statistics 22.0處理數(shù)據(jù)和作圖。數(shù)據(jù)結果間的顯著性差異采用t檢驗分析，置信區(qū)間設置在95%。

3 結果與分析

3.1 表層海水胞外酶活性水平分布

3.1.1 2017年春季黃、東海

2017年春季黃、東海表層海水溫度變化趨勢為由北向南逐漸升高，長江口附近受河流輸入的影響，鹽度較低。東海東南部受高溫、高鹽的黑潮水影響，溫度、鹽度均較高（圖2）。表層海水AP和LIP活性高值區(qū)均分布在C斷面，即蘇北沿岸至濟州島之間的海域，且最大值（AP：38 530 pmol/(L·h)，LIP：23 473 pmol/(L·h)）均出現(xiàn)在 C2 站位（33.75°N，122.15°E），酶活性以C2站位為最高值點向四周逐漸降低。CEL活性高值站位為蘇北沿岸的C1（413 pmol/(L·h)）、C3（456 pmol/(L·h)）站位，AGLU 活性高值區(qū)也分布在蘇北沿岸的 C1（558 pmol/(L·h)）、C3（494 pmol/(L·h)）站位，以及長江口外海海域的 P4（457 pmol/(L·h)）站位。AMP、CHI、BGAL、XYL均在長江口以東的外海存在高值區(qū)（圖2）。

黃、東海8種酶活性平均值排列順序由大到小依次為: AP（5 891 pmol/(L·h)）、LIP（4 760 pmol/(L·h)）、AMP（2 241 pmol/(L·h)）、CHI（235 pmol/(L·h)）、AGLU（155 pmol/(L·h)）、BGAL（155 pmol/(L·h)）、CEL（136 pmol/(L·h)）、XYL（71 pmol/(L·h)）（表 1），其中AGLU和BGAL的活性基本一致。

3.1.2 2018年春季膠州灣附近海域

圖2 2017年春季黃、東海表層海水溫度、鹽度及8種胞外酶活性水平分布Fig. 2 The distributions of temperature, salinity and eight extracellular enzyme activities in the surface waters of the Yellow Sea and the East China Sea during spring 2017

表1 2017年春季黃、東海表層海水溫度、鹽度和胞外酶活性的變化范圍及平均值Table 1 Variation and average of temperatures, salinities and eight extracellular enzyme activities in the Yellow Sea and the East China Sea during spring 2017

2018年春季膠州灣附近海域表層海水鹽度由近岸向遠岸逐漸增加。AP在8種胞外酶活性中最高（1 865 pmol/(L·h)），LIP 與 XYL 活性分布均為近岸高于遠岸，CHI活性分布趨勢為近岸低于遠岸，AMP活性分布大致為由北向南逐漸升高。LIP、AMP和CEL 均在膠州灣灣口處有高值（LIP：4 442 pmol/(L·h)；AMP：2 050 pmol/(L·h)；CEL：310 pmol/(L·h)），BGAL 活性最高值（423 pmol/(L·h)）站位為#3（圖 3）。

膠州灣附近海域胞外酶活性的平均值排列順序由大到小依次為：AP（1 865 pmol/(L·h)）、LIP（1 821 pmol/(L·h)）、AMP（1 499 pmol/(L·h)）、XYL（397 pmol/(L·h)）、AGLU（186 pmol/(L·h)）、BGAL（133 pmol/(L·h)）、CHI（109 pmol/(L·h)）、CEL（106 pmol/(L·h)）（表 2），其中CHI和CEL的活性基本一致。

圖3 2018年春季膠州灣附近海域表層海水溫度、鹽度及8種胞外酶活性水平分布Fig. 3 The distributions of temperature, salinity and eight extracellular enzyme activities in the surface waters of the Jiaozhou Bay nearby waters during spring 2018

用SPSS 22對酶活性平均值進行t檢驗。黃海的AP和LIP平均酶活性均顯著高于東海和膠州灣附近海域（p＜0.05）；BGAL、XYL 平均酶活性為東海顯著高于黃海（p＜0.05）；調(diào)查海域中的 AP、LIP、AMP 的平均酶活性均顯著高于其他5種酶活性（CHI、CEL、AGLU、BGAL、XYL）（p＜0.05）（圖 4）。

表2 2018年春季膠州灣附近海域表層海水溫度、鹽度和胞外酶活性的變化范圍及平均值Table 2 Variation and average of temperatures, salinities and eight extracellular enzyme activities in the Jiaozhou Bay nearby waters during spring 2018

3.2 相關性分析

圖4 2017年春季黃、東海和2018年春季膠州灣附近海域8種胞外酶的平均酶活性Fig. 4 Average activities of eight extracellular enzymes in the Yellow Sea and the East China Sea in spring 2017 and in Jiaozhou Bay nearby waters in spring 2018

將調(diào)查海域8種胞外酶活性之間，胞外酶活性與溫度、鹽度、Chla之間，AP活性與磷酸鹽濃度之間，AMP活性與氨氮、硝酸鹽、亞硝酸鹽、總溶解無機氮（之和）濃度之間運用SPSS 22作皮爾孫（Pearson）相關性分析。黃、東海表層海水中 AP 與 LIP活性（r=0.883，p＜0.01），AP與 CEL 活性（r=0.314，p＜0.05），CHI與 BGAL 活性（r=0.606，p＜0.01），CEL 與 AGLU 活性（r=0.862，p＜0.01）之間存在正相關；溫度與 BGAL（r=0.412，p＜0.01）、CHI（r=0.326，p＜0.05）活性呈正相關，與 LIP 活性呈負相關（r=-0.360，p＜0.05）（表 3，表 4）；AP 活性與磷酸鹽濃度呈正相關（r=0.311，p＜0.05），AMP 活性與無機氮鹽濃度之間無顯著相關性（p＞0.05）。

膠州灣附近海域海水中AP與XYL活性呈正相關（r=0.817，p＜0.01），其余酶活性之間無顯著相關性（p＞0.05）；LIP 活性與鹽度呈負相關（r=-0.851，p＜0.01）（表 4）。

4 討論

AP可由浮游植物、浮游動物和細菌產(chǎn)生，研究季節(jié)和海域不同，其來源主體也不盡相同[30]。AP活性受水體中溶解無機磷和小分子溶解有機磷濃度的影響[31]。磷酸鹽與AP活性之間的關系目前有兩種解釋：一種解釋是AP與磷酸鹽之間存在“抑制-誘導”機制，AP活性為磷脅迫的指示因子[32]。另外一種解釋是在富營養(yǎng)化水體中，AP與富營養(yǎng)化程度有關[33-35]。Taga和Kobori[33]對東京灣富營養(yǎng)化水體的研究表明，AP活性與磷酸鹽濃度呈正相關。在本次調(diào)查海域中，AP活性與磷酸鹽濃度呈正相關，與Taga和Kobori[33]的研究結果相似。這可能是因為調(diào)查海域水體營養(yǎng)鹽含量較高。蘇北沿岸有淮河、射陽河等多條河流入海，攜帶了大量的營養(yǎng)物質(zhì)，在沿岸水的作用下向外海擴張，同時蘇北淺灘處大量的水產(chǎn)養(yǎng)殖、紫菜養(yǎng)殖也造成了附近水體富營養(yǎng)化[36-37]。長江口河流輸入更是帶來大量營養(yǎng)鹽。磷酸鹽分布顯示長江口、蘇北沿岸及南黃海中部為正磷鹽高值區(qū)，其營養(yǎng)鹽濃度較開闊大洋[32]要高出很多。青島沿岸排污及人為活動向近海輸入營養(yǎng)鹽，導致近岸AP活性略高于遠岸，與2017年黃、東海結果相似。相關性分析顯示，在此海域AP活性與Chla無顯著相關性，表明浮游植物分泌產(chǎn)生的AP可能不是該海域游離態(tài)AP主要的貢獻者。本調(diào)查結果中黃、東海和膠州灣附近海域AP活性與宋福行[23]對膠州灣4月份的調(diào)查結果相近。

表3 2017年春季黃、東海和2018年春季膠州灣附近海域8種胞外酶活性之間的相關性分析Table 3 Correlation analysis between eight extracellular enzyme activities of the Yellow Sea and the East China Sea during spring 2017 and the Jiaozhou Bay nearby waters during spring 2018

表4 溫度、鹽度及Chl a與8種胞外酶活性的相關性分析Table 4 Relationship between temperature, salinity, Chl a and eight extracellular enzyme activities

LIP能夠?qū)⒅玖呀鉃楦视秃椭舅?，在脂質(zhì)轉(zhuǎn)化中起到主要作用。在水生生態(tài)系統(tǒng)中，LIP來源于活的微生物輸出或者在細胞破裂后作為游離酶釋放[38]。水體中的脂肪占所有有機物的3%～55%，主要來自于活的以及死亡的浮游植物、浮游動物和大型植物[39]。相關性分析結果顯示2017年春季黃、東海AP與LIP活性之間存在顯著正相關，LIP活性高值區(qū)與AP活性高值區(qū)基本吻合。春季南黃海中部海域上層水體溫度開始升高，Chla分布顯示南黃海中部區(qū)域存在Chla含量高值區(qū)，表明上層水體浮游生物隨溫度升高開始大量繁殖，加上蘇北沿岸大量水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對水體脂質(zhì)的輸送，導致該區(qū)域水體脂肪含量上升，這可能是該海域LIP活性高的原因。在東海的東南部因為受到高溫高鹽寡營養(yǎng)鹽的黑潮水入侵，Chla含量較低，所以該區(qū)域LIP活性也較低。2018年春季膠州灣LIP活性與鹽度呈顯著負相關，間接表明了該區(qū)域LIP活性可能與河流輸入有關。

在自然環(huán)境中，AMP和其他蛋白水解酶共同組成了細胞利用外源蛋白質(zhì)的微生物酶體系。多肽和蛋白質(zhì)是水體中微生物最重要也是最容易利用的碳、氮和能量來源，但它們必須先被胞外酶降解成小分子的肽或氨基酸才能被吸收利用，因此AMP對于微生物利用蛋白質(zhì)具有重要作用。AMP廣泛存在于海水中，由細菌、藍藻、浮游植物及浮游動物合成[21]。研究表明AMP與水體中的蛋白質(zhì)（藻類細胞降解產(chǎn)物）有關，AMP在藻華衰退期迅速合成[4]；谷體華等[40]在對臺灣海峽南部上升流區(qū)的研究得出，近岸高含量的溶解有機氮是誘導亮氨酸氨肽酶合成的主要原因。在山東半島南部至蘇北沿岸及長江口以東的外海因河流和人為輸入帶來了大量蛋白質(zhì)，可能導致該海域AMP活性較高。本調(diào)查結果中AMP活性與溶解無機氮之間無明顯的相關性，與Williams和Jochem[41]對佛羅里達灣的研究結果相同。黃、東海和膠州灣附近海域AMP活性低于谷體華等[40]對6月份臺灣海峽南部上升流區(qū)的調(diào)查（AMP：21.40 nmol/(L·h)），這主要與測定方法的底物濃度不同有關。

黃、東海和膠州灣附近海域表層海水中與糖類水解相關的酶（CHI、CEL、AGLU、BGAL、XYL）活性低于其他酶活性，與Brown和Goulder[20]及Mudryk和Skórczewski[42]等的結果相似，這可能是因為糖類水解酶的游離態(tài)在總酶中所占比例較小[43-44]。溫、鹽分布圖顯示在濟州島附近有一個向西南方向延伸的溫鹽舌，位于此處的D6站位多糖及總糖的濃度較高[45]，糖類水解酶的活性也比周圍的高。對比2017年春季黃、東海多糖濃度分布發(fā)現(xiàn)，多糖濃度高值區(qū)與糖類水解酶活性高值區(qū)存在重合，證明了酶活性與底物濃度直接相關。調(diào)查海域CHI和BGAL活性都與溫度呈正相關，Vetter和Deming[5]研究表明溫度對幾丁質(zhì)酶影響較明顯。除去溫度對酶活性的影響，也可能存在多糖濃度分布變化導致的酶活性變化。黃、東海表層海水酶活性相關性分析顯示CHI和BGAL、CEL和AGLU活性之間存在顯著正相關，Arrieta和Herndl[19]、Tholosan 等[46]及 Unanue等[47]對酶動力學研究表明有不同種類β-葡萄糖苷酶共同作用，表明這些酶之間可能存在共同作用來降解多糖。但也不排除是因為這些酶活性的影響因素大致相同而導致的酶活性分布出現(xiàn)相似性。除AMP以外，調(diào)查海域其余胞外酶活性均低于趙麗軍等[24]對秋末黃、渤海的調(diào)查，這主要與研究的季節(jié)、海區(qū)不同有關。

5 結論

酶活性分布受調(diào)查海域的營養(yǎng)狀況及相應底物濃度影響較大。2017年春季黃、東海表層海水中AP和LIP活性高值區(qū)出現(xiàn)在蘇北沿岸和南黃海中部。其余 6種酶（AMP、CHI、CEL、AGLU、BGAL、XYL）活性高值區(qū)出現(xiàn)在長江口以東的外海，AP活性與磷酸鹽濃度呈正相關（p＜0.05）。2018年春季膠州灣附近海域AP、LIP、XYL活性分布均大致為近岸高于遠岸，CHI活性為近岸低于遠岸。

2017年春季黃、東海表層海水中8種酶活性平均值排列順序由大到小依次為：AP、LIP、AMP、CHI、AGLU、BGAL、CEL、XYL，其中 AGLU 和BGAL 的活性基本一致。2018年春季膠州灣附近海域海水中8種酶活性平均值排列順序由大到小為：AP、LIP、AMP、XYL、AGLU、BGAL、CHI、CEL，其中 CHI 和 CEL 的活性基本一致。東海的BGAL、XYL平均酶活性顯著高于黃海。黃海的AP和LIP平均酶活性顯著高于東海和膠州灣附近海域。糖類水解酶（CHI、CEL、AGLU、BGAL、XYL）平均酶活性在黃海最低。

調(diào)查海域多種酶活性之間存在相關性。黃、東海表層海水中 AP與 LIP、CEL，CHI與 BGAL，CEL與AGLU活性之間均存在顯著正相關（p＜0.01），膠州灣附近海域海水中AP與XYL呈正相關（p＜0.01）。這些酶活性的影響因子可能相似，或在酶與酶之間可能存在協(xié)同作用。

致謝：本實驗2017年春季黃、東海Chla數(shù)據(jù)由廈門大學高亞輝老師課題組提供；營養(yǎng)鹽數(shù)據(jù)由中國海洋大學辛宇老師課題組提供，在此表示感謝。