劉力亨

南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 藥學(xué)部，南京 210008

膿毒癥引起的心肌病是膿毒癥和膿毒性休克的常見(jiàn)并發(fā)癥之一，其最早的臨床表現(xiàn)是心功能不全：左心室擴(kuò)張和射血分?jǐn)?shù)下降，并伴有細(xì)胞炎癥、凋亡與焦亡[1-3]。細(xì)胞焦亡[4]（pyroptosis）又稱(chēng)細(xì)胞炎性壞死，是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的一種程序性死亡方式。它依賴(lài)于半胱天冬酶（caspase-1）活化并通過(guò)切割消皮素（gasdermin D，GSDMD）得到其N(xiāo)端產(chǎn)物（GSDMD-NT），在細(xì)胞膜上成孔，使炎癥因子如白介素（IL-1β）、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）等分泌至細(xì)胞外，形成炎癥。

五味子丙素（schisandrin C，SchC）是傳統(tǒng)中草藥五味子中的主要成分之一，它具有多種藥理活性，包括抗炎、保肝、抗癌和免疫激活，并且可影響呼吸、心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[5，6]。研究報(bào)道，五味子丙素對(duì)阿昔洛韋誘導(dǎo)的（NOD-，LRR-and pyrin domain-containing protein 3，NLRP3）炎癥小體激活、IL-1β 分泌和細(xì)胞焦亡具有緩解作用[8]，但其對(duì)于脂多糖（LPS）引起的細(xì)胞焦亡的影響尚不明確。現(xiàn)利用小鼠心肌細(xì)胞HL-1研究五味子丙素對(duì)LPS引起的細(xì)胞焦亡和損傷的影響。

1 材 料

五味子丙素（SchC）購(gòu)自上海陶素生化科技有限公司（61301-33-5；10 mg）；脂多糖（LPS）和二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

小鼠心肌細(xì)胞HL-1購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記山羊抗體兔IgG購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；抗微管蛋白（Tubulin）兔單克隆抗體、Caspase1兔多克隆抗體、消皮素D（Gasdermin D，GSDMD）兔多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司；抗NLRP3兔多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜與曝光系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司；IL-1β、HMGB1、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；小鼠GSDMD特異性siRNA購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；脂質(zhì)體2000（Lipofectamine 2000）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

2 方 法

2.1 SchC的配制

將SchC粉末用DMSO配制成5、10、20、50、100、150、200 mmol·L-1；MTT實(shí)驗(yàn)時(shí)，加入1 μL各濃度SchC至100 μL培養(yǎng)基中（DMSO濃度為1%）；其余實(shí)驗(yàn)，加入1 μL各濃度SchC至1 mL培養(yǎng)基中（DMSO濃度為0.1%）。

2.2 HL-1細(xì)胞培養(yǎng)

將HL-1細(xì)胞接種到DMEM高糖培養(yǎng)基（含100 μ·mL-1鏈霉素、100 μ·mL-1青霉素和10%胎牛血清）中培養(yǎng)，每48 h換液1次，2～3 d傳代1次，傳代2次取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 MTT法預(yù)實(shí)驗(yàn)選定SchC濃度

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-1細(xì)胞接種于96孔板中，分別加入0、5、10、20、50、100、150、200 μmol·L-1的SchC，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.4 分組

①將HL-1細(xì)胞分組，設(shè)立對(duì)照組、LPS（1 mg·L-1）組、LPS（1 mg·L-1）+SchC（5、10、20 μmol·L-1）組，SchC孵育細(xì)胞1 h后再經(jīng)LPS處理24 h、48 h，收集細(xì)胞上清液進(jìn)行ELISA，收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot和MTT實(shí)驗(yàn)；②將HL-1細(xì)胞分組，設(shè)立對(duì)照組、LPS（1 mg·L-1）組、siGSDMD組、LPS（1 mg·L-1）+siGSDMD組、LPS（1mg·L-1）+siGSDMD+SchC（20μmol·L-1）組，HL-1細(xì)胞經(jīng)GSDMD的siRNA（10 nmol·L-1）處理細(xì)胞24 h后再經(jīng)SchC孵育1 h，最后用LPS處理細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞上清液進(jìn)行ELISA，收集細(xì)胞進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。

2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

采用MTT法，選取對(duì)細(xì)胞增殖影響小的SchC濃度組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。①分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-1細(xì)胞接種于96孔板中，分別加入5、10、20 μmol·L-1的SchC提前孵育1 h后，加入LPS（1 mg·L-1）處理，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h或48 h；②分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-1細(xì)胞接種于96孔板中，GSDMD特異性siRNA處理HL-1細(xì)胞24 h后SchC再孵育1 h，加入LPS（1 mg·L-1）處理，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h或48 h。每孔加人20 μL MTT（5 mg·mL-1）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心后小心吸盡上清液，每孔加入150 μL DMSO吹打混勻，采用酶標(biāo)儀于570 nm處讀取各孔吸光度值。按公式AX/ADMSO計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

2.6 ELISA檢測(cè)細(xì)胞IL-1β、HMGB1和TNF-α的表達(dá)

細(xì)胞因子（IL-1β、HMGB1和TNF-α）水平檢測(cè)：按照3×106個(gè)/皿將HL-1細(xì)胞接種在6孔板中，給予藥物后孵育1h，加入1mg·L-1LPS，24h后收集細(xì)胞上清液，并檢測(cè)細(xì)胞蛋白濃度。96孔ELISA板包被細(xì)胞因子的捕獲抗體，4 ℃過(guò)夜。次日，運(yùn)用含0.1‰吐溫20的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌3次，吸水紙拍干剩余液體，用BSA封閉含有抗體的ELISA板1 h，加入細(xì)胞培養(yǎng)上清液，室溫孵育2h。2h后運(yùn)用PBST洗滌3次，加入細(xì)胞因子的檢測(cè)抗體，室溫孵育1 h。1 h后運(yùn)用PBST洗滌3次，加入Strapavaidin-HRP，室溫孵育30 min。隨后加入HRP顯色底物（TMB）室溫避光孵育15 min。15 min后加入終止緩沖液（4%H2SO4），運(yùn)用酶標(biāo)檢測(cè)儀于450 nm處檢測(cè)吸光度。

2.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞Caspase1、GSDMDN端和NLRP3的表達(dá)

細(xì)胞裂解后，測(cè)定蛋白濃度并配平每個(gè)蛋白的上樣量。等量蛋白通過(guò)SDS膠進(jìn)行分級(jí)分離，然后濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，分子量小的用0.2 μm孔徑的膜，分子量大的用0.45 μm孔徑的膜。90 min后用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，待封閉好后加入一抗（抗Caspase1兔多克隆抗體、抗GSDMD兔多克隆抗體、抗NLRP3兔多克隆抗體和抗Tubulin兔單克隆抗體，稀釋均為1∶1000），置室溫?fù)u床孵育2 h后移至4 ℃搖床過(guò)夜。次日加入HRP結(jié)合的二抗（1∶3000），二抗孵育1 h后用TBST洗滌3次。加ECL液避光孵育2 min，用曝光儀成像。

2.8 siRNA誘導(dǎo)的基因沉默

利用特異性siRNA序列實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的基因沉默。采用Lipofectamine 2000將10 nmol·L-1的siRNA轉(zhuǎn)染至HL-1細(xì)胞，具體操作根據(jù)說(shuō)明書(shū)指示進(jìn)行。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用Student’s t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析并以Bonferroni校正。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 低劑量的SchC不影響HL-1細(xì)胞增殖

MTT法檢測(cè)各濃度對(duì)HL-1細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，100 μmol·L-1及以上濃度的SchC可明顯抑制HL-1細(xì)胞增殖（P<0.01），見(jiàn)圖1。表明高濃度SchC對(duì)HL-1細(xì)胞有著細(xì)胞毒性作用，可能會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，故只使用5、10、20 μmol·L-1濃度的SchC。

3.2 SchC劑量依賴(lài)性抑制LPS引起的HL-1細(xì)胞活力

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在LPS（1 mg·L-1）處理24 h或48 h條件下，與對(duì)照組相比，LPS組HL-1細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.01），而SchC可劑量依賴(lài)性改善LPS誘導(dǎo)的HL-1細(xì)胞活力下降，見(jiàn)圖2A～B。表明SchC可緩解LPS誘導(dǎo)的HL-1細(xì)胞活力下降。

3.3 SchC抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡

不同濃度SchC（5、10、20 μmol·L-1）預(yù)先處理HL-1細(xì)胞1 h后，LPS（1 mg·L-1）刺激細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清液檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子IL-1β、HMGB1、TNF-α 的分泌水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS可上調(diào)IL-1β、HMGB1和TNF-α 的分泌水平，經(jīng)SchC處理后，HL-1細(xì)胞的IL-1β、HMGB1、TNF-α 的分泌水平降低，且SchC濃度越大，其抑制效果越佳，見(jiàn)圖3A～C。

不同濃度SchC（5、10、20 μmol·L-1）預(yù)先處理HL-1細(xì)胞1 h后，LPS（1 mg·L-1）刺激細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞、檢測(cè)活化的炎性半胱天冬酶（cleaved-Caspase1）和GSDMD-N端的蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS可上調(diào)cleaved-Caspase1、GSDMD-N端和NLRP3的蛋白表達(dá)，經(jīng)SchC處理后，HL-1細(xì)胞的cleaved-Caspase1、GSDMD-N端和NLRP3的蛋白表達(dá)呈劑量依賴(lài)性降低，見(jiàn)圖4A～D。表明SchC可降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。

3.4 SchC通過(guò)減少細(xì)胞焦亡緩解LPS引起的HL-1細(xì)胞活力下降

后續(xù)為確證SchC通過(guò)減少細(xì)胞焦亡緩解LPS引起的細(xì)胞活力下降。利用siRNA沉默HL-1細(xì)胞的GSDMD的表達(dá)后，SchC預(yù)處理1 h，再用LPS處理24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默GSDMD后，LPS引起HL-1細(xì)胞的IL-1β 水平有明顯降低，但SchC預(yù)處理組與siGSDMD＋LPS組相比并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)圖5 A～B；MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默GSDMD后，LPS引起的HL-1細(xì)胞活力有明顯上升，但SchC預(yù)處理組與siGSDMD＋LPS組相比并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)圖5C。表明SchC可能通過(guò)減少細(xì)胞焦亡緩解LPS引起的細(xì)胞損傷。

4 討論

現(xiàn)已證明，內(nèi)毒素在機(jī)體的膿毒性反應(yīng)中起著觸發(fā)劑的作用，在激活的連鎖反應(yīng)中，細(xì)胞因子可能起核心作用[7]。研究報(bào)道，LPS引起小鼠心臟炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡與焦亡，從而導(dǎo)致小鼠心功能異常[3，8]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡與感染性疾病、自發(fā)炎癥性疾病和自身免疫性疾病等密切相關(guān)[9-11]。在細(xì)胞焦亡發(fā)生初期，通過(guò)識(shí)別LPS等細(xì)胞外感染源，激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥小體NLRP3活化以及pro-Caspase家族蛋白、pro-IL-1β 和pro-IL-18的轉(zhuǎn)錄合成，而后依賴(lài)Caspase家族蛋白剪切上述蛋白前體與執(zhí)行蛋白GSDMD，從而激活細(xì)胞焦亡。其中GSDMD在細(xì)胞焦亡過(guò)程中起著執(zhí)行者的角色，測(cè)定炎性半胱天冬酶（Caspase）通過(guò)剪切GSDMD形成含有GSDMD-N端活性域的肽段，以及IL-1β 和IL-18等細(xì)胞因子的水平，可以從一定程度反應(yīng)機(jī)體的焦亡過(guò)程和炎癥水平。目前應(yīng)用于臨床的治療膿毒癥心肌損傷的藥物很少，由細(xì)胞焦亡在膿毒癥誘發(fā)心肌損傷的重要性出發(fā)，對(duì)尋找新的治療藥物有著重要意義。

五味子丙素（SchC）是五味子的一種二苯并環(huán)辛二烯衍生物，被證明能夠緩解脂磷壁酸刺激小膠質(zhì)細(xì)胞和痤瘡丙酸桿菌、引起巨噬細(xì)胞的細(xì)胞炎癥[7，8]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)LPS誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞24 h后，炎癥因子IL-1β、TNF-α、HMGB-1的分泌水平顯著升高。當(dāng)給予SchC預(yù)處理心肌細(xì)胞1 h后發(fā)現(xiàn)，炎癥因子IL-1β、TNF-α、HMGB-1的分泌水平明顯降低，這說(shuō)明SchC是通過(guò)抑制炎癥因子的分泌、緩解LPS誘導(dǎo)過(guò)程心肌損傷。由Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示，LPS刺激小鼠心肌細(xì)胞24 h后，Cleaved-Caspase1、GSDMD-N端、NLRP3的蛋白水平顯著升高，SchC預(yù)處理LPS刺激的小鼠心肌細(xì)胞1h后，Cleaved-Caspase1、GSDMD-N端、NLRP3的蛋白水平呈劑量依賴(lài)性降低。這預(yù)示著SchC的抗細(xì)胞損傷活性可能是由于降低了細(xì)胞焦亡的激活。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一設(shè)想，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用GSDMD的siRNA沉默心肌細(xì)胞的GSDMD表達(dá)，繼而用SchC處理細(xì)胞后LPS刺激細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示，SchC在GSDMD缺失的情況下，無(wú)法發(fā)揮其抗炎和抗細(xì)胞損傷作用，表明SchC對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損傷的緩解作用源自其對(duì)細(xì)胞焦亡的抑制活性。

綜上所述，本研究表明，SchC能有效抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡的激活而緩解心肌細(xì)胞損傷，這可能是一個(gè)有效治療膿毒癥心肌損傷和緩解心功能異常的有效單體成分。