江 豐, 余婷婷, 李 珉, 榮 茂, 韓 莉, 宋 哲, 朱曉玲

(湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院, 湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心, 湖北 武漢 430075)

多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls, PCBs),是聯(lián)苯的1～10位上的氫原子被氯原子取代后形成的氯代烴類化合物,其同分異構(gòu)體和同系物多達(dá)209種[1],性質(zhì)穩(wěn)定,在自然環(huán)境中極難分解,因此具有環(huán)境持久性、遠(yuǎn)距離遷移性和生物蓄積性等特點(diǎn),給人體健康和生態(tài)系統(tǒng)造成了潛在的威脅[2,3],是斯德哥爾摩公約中優(yōu)先控制的12類持久性有機(jī)污染物之一。目前PCBs在水體、土壤、水生生物、野生動(dòng)植物乃至人乳及其脂肪中都有檢出[4,5]。對人類而言,除職業(yè)暴露外,食物攝入是最重要的途徑,占人體接觸量的90%以上,其中動(dòng)物性食品是主要來源[6]。因此,研究水產(chǎn)品中痕量PCBs的檢測方法,對了解和掌握水產(chǎn)品中PCBs的污染狀況至關(guān)重要。

當(dāng)前檢測水產(chǎn)品中PCBs含量的技術(shù)有氣相色譜配置電子捕獲檢測器(GC-ECD)[7,8]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)[9,10]和氣相色譜-高分辨質(zhì)譜(GC-HRMS)[11]。ECD對檢測鹵代化合物有很高的靈敏度,但是缺乏選擇性;GC-MS/MS使用多反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM/MRM)時(shí)在一定程度上增加了分析的敏感性和特異性,但由于水產(chǎn)品的基質(zhì)復(fù)雜,且PCBs的含量可能在ng甚至pg水平,干擾較為嚴(yán)重。而GC-HRMS通過選擇離子的精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行測定,其質(zhì)量數(shù)可精確到小數(shù)點(diǎn)后四位,從而避開了其他具有相同整數(shù)離子的干擾,大大地降低了化學(xué)噪聲,使其具有高靈敏度、抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)。

由于水產(chǎn)品中含有大量油脂,干擾組分復(fù)雜,凈化不徹底會(huì)造成結(jié)果的不準(zhǔn)確,甚至?xí)绊懛治鰞x器的使用壽命,因此,樣品的提取、凈化和測定成為目前水產(chǎn)品中PCBs殘留分析的難點(diǎn)。水產(chǎn)品中PCBs的提取方法主要有索氏萃取、超聲萃取和加速溶劑萃取(ASE)等[12]。索氏萃取過程繁瑣耗時(shí),超聲萃取效率有待提高,而加速溶劑萃取具有萃取效率高、溶劑用量少、耗時(shí)短、全自動(dòng)化和回收率高等優(yōu)點(diǎn),在水產(chǎn)品目標(biāo)物的提取中獲得越來越廣泛的應(yīng)用。且在線凈化-ASE技術(shù)采用在萃取池中填入合適吸附劑,選擇性吸附樣品中的雜質(zhì),可以達(dá)到萃取凈化同步完成的目的,極大地節(jié)省了操作時(shí)間和步驟,常用的吸附劑有活性炭、C18樹脂、酸化硅膠、硅膠、氧化鋁、弗羅里硅土,可以在線除去有機(jī)物、脂肪、色素等雜質(zhì),但目前主要應(yīng)用于土壤中環(huán)境污染物的測定[13-15],而水產(chǎn)品中PCBs的提取和凈化卻鮮有報(bào)道。濃硫酸磺化法可有效地除去提取液中的脂肪、色素和雜質(zhì)[16],進(jìn)一步除去ASE未吸附的雜質(zhì)。國標(biāo)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中指示性多氯聯(lián)苯含量的測定》[17]第二法(氣相色譜法)也采用了濃硫酸凈化的方式。

本工作采用ASE同步凈化-同位素內(nèi)標(biāo)-GC-HRMS,建立了水產(chǎn)品中32種PCBs的測定方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

氣相色譜-高分辨質(zhì)譜(DFS,美國ThermoFisher公司);氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(7000D,美國Agilent公司);加速溶劑萃取儀(E-916,瑞士BUCHI公司);真空冷凍干燥機(jī)(Benchtop pro,美國Virtis公司);快速溶劑蒸發(fā)儀(Rocket,英國GeneVac公司);電子天平(AL204,瑞士Mettler Toledo公司)。

32種PCBs(PCB8、PCB28、PCB37、PCB44、PCB49、PCB52、PCB60、PCB66、PCB70、PCB74、PCB77、PCB82、PCB87、PCB99、PCB101、PCB105、PCB114、PCB118、PCB126、PCB128、PCB138、PCB153、PCB156、PCB158、PCB166、PCB169、PCB170、PCB179、PCB180、PCB183、PCB187、PCB189)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL,美國Accustandard公司); PCBs定量內(nèi)標(biāo)(13C12-PCB28、13C12-PCB52、13C12-PCB118、13C12-PCB153、13C12-PCB180)標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.0 μg/mL,加拿大Wellington Laboratries公司)、PCBs回收率內(nèi)標(biāo)(13C12-PCB101)標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.0 μg/mL,加拿大Wellington Laboratories公司)。

丙酮、二氯甲烷(色譜純,美國Fisher公司);正己烷(色譜純,美國Merck公司)。無水硫酸鈉、中性氧化鋁、弗羅里硅土(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),使用前均在550 ℃下烘烤6 h,待用。

水產(chǎn)品樣品來自湖北省內(nèi)各地集貿(mào)市場。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

PCBs混合標(biāo)準(zhǔn)中間液(100 μg/L):準(zhǔn)確量取0.1 mL 32種PCBs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中,用正己烷定容至刻度。

PCBs混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液:分別準(zhǔn)確量取適量PCBs混合標(biāo)準(zhǔn)中間液于不同10 mL容量瓶中,用正己烷分別定容至刻度。配制成PCBs混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液,質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1、2、5、10、20 μg/L。使用時(shí),分別吸取100 μL PCBs混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液于裝有0.2 mL錐形襯管的進(jìn)樣瓶中,再分別加入1 μL定量內(nèi)標(biāo)和回收率內(nèi)標(biāo)。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品采集與制備

現(xiàn)場采集的水產(chǎn)品用鋁箔包裝,置冷凍箱中運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室,于-10 ℃下低溫保存。在制備時(shí),取可食部分約200 g絞碎,然后裝入塑料瓶中在真空冷凍干燥儀中冷凍干燥48 h,取出后研磨粉碎,置于-18 ℃下密封冷凍保藏待用。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1.0 g凍干樣品與石英砂攪拌均勻,隨后轉(zhuǎn)移至已依次加入2 g無水硫酸鈉、1 g弗羅里硅土、50 g中性氧化鋁的100 mL不銹鋼萃取池中,再加入定量內(nèi)標(biāo)1 μL,放置30 min后,進(jìn)行加速溶劑萃取。ASE儀條件為:提取試劑二氯甲烷-正己烷(1∶1, v/v),系統(tǒng)壓力10 Mpa,萃取溫度100 ℃,加熱時(shí)間300 s,萃取時(shí)間180 s,清洗體積為萃取池體積的40% ,氮?dú)獯祾邥r(shí)間100 s,循環(huán)2次。

萃取液經(jīng)快速溶劑蒸發(fā)儀濃縮至約近干后,將濃縮的提取液轉(zhuǎn)移至15 mL試管中,用約5 mL正己烷洗滌蒸發(fā)管3～4次,洗液并入濃縮液中,用正己烷定容至刻度,并加入0.5 mL濃硫酸,振搖1 min,以 3 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min,使硫酸層和有機(jī)層分離。重復(fù)操作1次。吸取上層溶液至10 mL玻璃試管中,在氮?dú)庀聺饪s至近干,加入100 μL正己烷,轉(zhuǎn)移至裝有0.2 mL錐形襯管的進(jìn)樣瓶中,加入1 μL回收率內(nèi)標(biāo)溶液,待上機(jī)分析。

1.4 分析條件

1.4.1 氣相色譜-高分辨質(zhì)譜

氣相色譜 毛細(xì)管色譜柱:TRDIOXIN-5MS毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.1 μm);進(jìn)樣口溫度:280 ℃;傳輸線溫度:280 ℃;升溫程序:初始溫度100 ℃,保持2 min,以15 ℃/min 升溫速率升至180 ℃,再以3 ℃/min 升至240 ℃,再以10 ℃/min 升至300 ℃,保持10 min。進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣;柱流速:1.2 mL/min,恒流模式;載氣:氦氣(純度≥ 99.999% );進(jìn)樣量:1 μL。

高分辨質(zhì)譜 電子轟擊離子(EI)源,離子源電壓45 eV;離子源溫度260 ℃;溶劑延遲時(shí)間10 min;分辨率≥ 10 000;選擇離子監(jiān)測(SIM)模式(PCBs保留時(shí)間和特征碎片離子的質(zhì)量數(shù)信息見表1)。

表 1 32種PCBs和6種同位素內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間和特征碎片離子的質(zhì)量數(shù)Table 1 Retention times and masses of characteristic fragment ions of 32 PCBs and 6 isotopic internal standards

表 1 (續(xù))Table 1 (Continued)

1.4.2 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

氣相色譜條件:同1.4.1節(jié)。

質(zhì)譜條件:電子轟擊離子源(EI),離子源電壓:70 eV;離子源溫度:260 ℃;溶劑延遲時(shí)間:10 min;全掃描(Full-Scan)模式,掃描離子范圍:m/z50～450。

1.5 計(jì)算

定量方法采用內(nèi)標(biāo)法,首先用回收率內(nèi)標(biāo)計(jì)算樣品中定量內(nèi)標(biāo)的回收率:用13C12-PCB101作為13C12-PCB28、13C12-PCB52、13C12-PCB118、13C12-PCB153和13C12-PCB180的內(nèi)標(biāo),樣品中定量內(nèi)標(biāo)的回收率應(yīng)在60% ～120%之間。樣品中定量內(nèi)標(biāo)的回收率滿足要求后,再用定量內(nèi)標(biāo)計(jì)算樣品中每個(gè)待測PCBs的含量。每族PCBs使用一個(gè)相同氯代程度的同位素內(nèi)標(biāo)物作為定量內(nèi)標(biāo):三氯聯(lián)苯用13C12-PCB28、四氯聯(lián)苯用13C12-PCB52、五氯聯(lián)苯用13C12-PCB118、六氯聯(lián)苯用13C12-PCB153、七氯聯(lián)苯用13C12-PCB180作為內(nèi)標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 氣相色譜-高分辨質(zhì)譜條件的建立

32種PCBs標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μg/L)和6種同位素內(nèi)標(biāo)(20 μg/L)的總離子流色譜圖見圖1。表1列出了32種PCBs和6種同位素內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間。

圖 1 32種多氯聯(lián)苯(20 μg/L)和6種同位素內(nèi)標(biāo)(20 μg/L)標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of standard solutions of 32 PCBs (20 μg/L) and 6 isotope internal standards (20 μg/L)

2.2 ASE條件的優(yōu)化

2.2.1 吸附材料的選取

動(dòng)物性樣品經(jīng)萃取后,需要把共提的脂肪雜質(zhì)分離除去,然后測定。Bj?rklund等[14]采用加速溶劑萃取法從豬油、魚肝油等含脂肪樣品中提取多氯聯(lián)苯時(shí)發(fā)現(xiàn):當(dāng)脂肪/脂肪吸附劑質(zhì)量比為1∶40時(shí),弗羅里硅土、堿性氧化鋁、中性氧化鋁、酸性氧化鋁和酸性硅膠這5種類型的脂肪吸附劑均能較好的吸附脂肪,因此,為省去萃取后的凈化步驟,本實(shí)驗(yàn)針對水產(chǎn)品的基質(zhì)特點(diǎn),選用價(jià)格較為廉價(jià)的中性氧化鋁作為脂肪的吸附劑。另外,選用弗羅里硅土作為色素的吸附劑,用無水硫酸鈉作為水的吸附劑。本實(shí)驗(yàn)將吸附劑、石英砂和樣品一起加入到萃取管中,并做未加吸附劑對比實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,加入吸附劑,萃取液在濃縮后,旋蒸管中未見明顯油狀物,而未加吸附劑時(shí),黃色油狀物非常明顯,且濃縮所需時(shí)間較長。因此,本方法可在提取PCBs時(shí),達(dá)到同步凈化的目的。

圖 2 萃取溶劑對5種13C12-PCBs回收率的影響Fig. 2 Effects of extraction solvent on the recoveries of the five 13C12-PCBs

2.2.2 萃取溶劑的影響

大量研究表明,丙酮、二氯甲烷和正己烷等相互混合溶劑對PCBs的萃取效果優(yōu)于單獨(dú)使用正己烷等溶劑[12]。為避免樣品本底值對分析結(jié)果的影響,本文以13C12-PCB28、13C12-PCB52、13C12-PCB118、13C12-PCB153和13C12-PCB180作為分析對象,以13C12-PCB101作為內(nèi)標(biāo),分別對不同溶劑的萃取效率進(jìn)行研究,結(jié)果見圖2。由圖2可看出,正己烷-丙酮(體積比1∶1)、二氯甲烷-丙酮(體積比1∶1)、二氯甲烷-正己烷(體積比1∶1)的提取效果沒有明顯差異,但均比單一使用二氯甲烷、丙酮和正己烷的效果要好。在凈化效果的影響上,使用丙酮后,提取液濃縮后有較明顯的油狀物,這主要是丙酮的極性較強(qiáng),降低了脂肪吸附劑吸附脂肪的能力[15],故最終選擇二氯甲烷-正己烷(體積比1∶1)為提取溶劑。

2.2.3 萃取溫度的影響

ASE溫度一般選擇在80～120 ℃之間,在其他萃取條件相同的情況下,以萃取溫度為變量,分別考察80、100和120 ℃ 3個(gè)溫度水平對提取效果的影響,3次平均結(jié)果見圖3。由圖3可知,幾種同位素內(nèi)標(biāo)的回收率隨著萃取溫度的升高而呈現(xiàn)先升高后平緩的趨勢,這主要是因?yàn)?溫度的升高不僅可以提高PCBs在萃取溶劑中的溶解度,還能夠降低萃取溶劑的黏度和表面張力,這樣就能使溶劑快速滲透到樣品基質(zhì)中,加大PCBs的擴(kuò)散速率,從而使提取效果變好[13]。然而,過高的溫度會(huì)降低脂肪吸附劑吸附脂肪的能力[15]。綜上考慮,選擇100 ℃作為PCBs的萃取溫度。

圖 3 萃取溫度對5種13C12-PCBs回收率的影響Fig. 3 Effects of extraction temperature on the recoveries of the five 13C12-PCBs

圖 4 萃取循環(huán)次數(shù)對5種13C12-PCBs回收率的影響Fig. 4 Effects of extraction cycles on the recoveries of the five 13C12-PCBs

2.2.4 循環(huán)次數(shù)的影響

在其他萃取條件相同的情況下,以循環(huán)次數(shù)作為變量,分別考察1、2和3次循環(huán)對提取效果的影響,由圖4可知,采用循環(huán)2次提取可使回收率提高8% ～18% ,循環(huán)3次與循環(huán)2次的提取效果差別不大,而增加1次循環(huán)會(huì)增加萃取時(shí)間約20 min、溶劑約30 mL,因此選定循環(huán)2次操作。

2.3 凈化方式的優(yōu)化

雖然加速溶劑萃取儀中吸附劑對樣品具有較強(qiáng)的凈化能力,但仍有微量的脂肪和少量的色素和其他雜質(zhì)未除去,因此需要進(jìn)一步凈化。考慮到PCBs具有高度耐酸的能力[18]和濃硫酸凈化的便捷性,本文采用硫酸凈化法。但由于濃硫酸具有強(qiáng)氧化性,若濃硫酸一次性加入量過大,會(huì)使PCBs發(fā)生氧化反應(yīng),從而降低PCBs的回收率。因此本研究采用多次少量加入濃硫酸凈化的方式,直至待凈化層溶液沒有顏色。實(shí)驗(yàn)中一般加入2次硫酸、每次0.5 mL可以達(dá)到凈化效果。從圖5可知,空白海鱸魚樣品經(jīng)硫酸凈化和不經(jīng)硫酸凈化的GC-MS總離子流圖有明顯的差異,硫酸凈化后峰的個(gè)數(shù)和強(qiáng)度明顯的降低,這說明硫酸對于樣品中的其他雜質(zhì)有較好的去除作用。采用空白海鱸魚加標(biāo)(20 ng/kg)比較采取硫酸凈化和不采取硫酸凈化對回收率的影響,硫酸凈化前后32種PCBs回收率范圍分別為85.3%～118.7%和80.5%～115.3%,表明硫酸凈化對回收率的影響較小。因此,用硫酸進(jìn)一步凈化過程,操作簡單,無需復(fù)雜的固相萃取步驟,且成本低廉、溶劑使用量少,適用于大批量樣品的快速處理。

圖 5 海鱸魚樣品經(jīng)硫酸凈化和不經(jīng)硫酸凈化的GC-MS總離子流圖Fig. 5 GC-MS total ion chromatograms of sea bass samples after sulfuric acid purification and without sulfuric acid purification

2.4 線性范圍和檢出限

將PCBs系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1、0.5、1、2、5、10、20 μg/L)進(jìn)樣,利用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定性、定量分析。試驗(yàn)采用同位素稀釋法的相對響應(yīng)因子對目標(biāo)物進(jìn)行定性、定量分析。通過各目標(biāo)化合物及同位素內(nèi)標(biāo)的相對保留時(shí)間、特征離子及特征離子峰間的同位素比值進(jìn)行定性分析。通過提取內(nèi)標(biāo)對目標(biāo)物進(jìn)行定量分析,計(jì)算出32種目標(biāo)物和5種13C定量內(nèi)標(biāo)的平均相對響應(yīng)因子(RRF)及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍在0.1～20 μg/L 之間,RRF的RSD值均小于15% (n=7),表明各PCBs的RRF結(jié)果穩(wěn)定,定量可以采用平均RRF進(jìn)行計(jì)算。

采用加標(biāo)回收的方法,以信噪比為3(S/N=3)確定檢出限(LOD),以S/N=10確定定量限(LOQ),結(jié)果見表2。結(jié)果顯示,32種PCBs的定量限為0.3～1.9 ng/kg。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中指示性多氯聯(lián)苯含量的測定》[17]采用氣相色譜-四極桿質(zhì)譜法或氣相色譜-離子阱質(zhì)譜法測定食品中的PCBs,多氯聯(lián)苯的定量限為0.5 μg/kg,本方法采用GC-HRMS的定量限比GB 5009.190-2014中的定量限降低了2～3個(gè)數(shù)量級(jí),說明本方法具有很高的靈敏度。

2.5 回收率和精密度

在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下,分別選擇脂肪含量較少的草魚(含量3.50% )和脂肪含量較多的海鱸魚(含量18.52% )做加標(biāo)回收試驗(yàn),3個(gè)添加水平分別為5、20和50 ng/kg,每個(gè)水平做6個(gè)平行樣,得到的回收率和精密度數(shù)據(jù)見表3。在低、中、高3個(gè)添加水平下,32種PCBs的平均回收率為71.9% ～119.0% ,RSD為3.5% ～19.6% ,表明方法的準(zhǔn)確度和精密度均能達(dá)到滿意結(jié)果。

2.6 實(shí)際樣品測定

采用本文方法對湖北省常見水產(chǎn)品(包括草魚、鯽魚、武昌魚、財(cái)魚、黃鱔等)進(jìn)行了分析測定,在所有水產(chǎn)品中均檢出多個(gè)PCBs單體,32種PCBs的含量總和在0.51～8.9 μg/kg 之間。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》[19]中PCBs的限量指標(biāo)以7種指示性PCBs的總和計(jì),水產(chǎn)動(dòng)物及其制品<0.5 mg/kg。湖北省常見水產(chǎn)品中PCBs的檢出量均沒有超出國家標(biāo)準(zhǔn)限值。

表 2 多氯聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對響應(yīng)因子平均值及RSD、檢出限及定量限Table 2 Average relative response factors (RRF), relative standard deviations (RSDs), limits of detection (LODs)and limits of quantitation (LOQs) for PCBs standard solution

RRF: relative response factor.

表 3 草魚和海鱸魚中32種多氯聯(lián)苯的加標(biāo)回收率和RSD(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of the 32 PCBs in grass carp and sea bass (n=6)

表 3 (續(xù))Table 3 (Continued)

3 結(jié)論

本工作建立了加速溶劑萃取同步凈化-同位素內(nèi)標(biāo)-氣相色譜-高分辨質(zhì)譜測定水產(chǎn)品中32種多氯聯(lián)苯的方法,將水產(chǎn)品中多氯聯(lián)苯的萃取和凈化合二為一,有效去除脂肪和提高萃取效率,且采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量,顯著提高了準(zhǔn)確性;另外,利用氣相色譜-高分辨質(zhì)譜作為檢測手段,靈敏度得到顯著提高。該方法具有背景干擾低、靈敏度高、重現(xiàn)性好、回收率穩(wěn)定等特點(diǎn),能夠滿足國內(nèi)外對水產(chǎn)品中PCBs的檢測要求。