方 真, 曲 栗, 古淑青*, 陳柔含, 李 優(yōu), 鄧曉軍, 郭德華, 馮 峰

(1. 上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心, 上海 200135; 2. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食品工程系, 上海 200436; 3. 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院, 北京 100176)

真菌毒素是一種由產(chǎn)毒絲狀真菌在一定環(huán)境條件下產(chǎn)生的具有毒性作用的次級代謝產(chǎn)物[1],易污染農(nóng)產(chǎn)品、食品和中藥材等植物源性產(chǎn)品。目前已知的真菌毒素超過300多種,其中大約有30種易對人體健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅,包括黃曲霉毒素(AFT)、赭曲霉毒素A(OTA)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)等,過量攝入受污染的食品會導(dǎo)致肝腎功能損壞、致癌、致畸,或誘發(fā)免疫抑制性疾病[2,3]。隨著真菌毒素風(fēng)險評估工作的不斷深入,許多地區(qū)和國家都對真菌毒素的含量進(jìn)行了強制性規(guī)定。我國GB 2761-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》中對上述多種真菌毒素最為嚴(yán)格的限量為5 μg/kg,而歐盟等國家則為2 μg/kg。

目前食品中真菌毒素的檢測方法主要有以酶聯(lián)免疫吸附測定法[4]和薄層色譜法[5]為主的定性和半定量檢測方法,以及以毛細(xì)管電泳法[6]、液相色譜法[7]為主的定量分析檢測方法。這些傳統(tǒng)檢測方法操作簡單,成本低廉,但定性干擾大,定量靈敏度不足,且只能一次實現(xiàn)一種或一類真菌毒素的定性和定量分析,無法滿足實際樣品中多種痕量真菌毒素污染物同時檢測的需求。近年來,隨著質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展,高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)在檢測毒素方面的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)[8]。HPLC-MS/MS結(jié)合了色譜的分離能力與質(zhì)譜的分子確證功能,兼具高靈敏與高特異性的優(yōu)點,是同時檢測多種毒素的理想方法,近年來被廣泛應(yīng)用于不同樣品中真菌毒素的定性、定量分析[8,9]。

在基于HPLC-MS/MS的檢測工作中,樣品前處理是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。真菌毒素檢測的前處理過程通常包括萃取和凈化兩個步驟。加速溶劑萃取(accelerated solvent extraction, ASE)是近年來新興的一種萃取技術(shù),在較高的溫度和壓力下,利用一定配比的有機溶劑對固體樣品進(jìn)行萃取[10]。ASE不僅能夠提高目標(biāo)化合物的萃取效率,而且能夠減少萃取溶劑的使用量,縮短萃取時間。QuEChERS凈化方法是近年來最新發(fā)展起來的一種主要用于農(nóng)殘檢測的前處理方法[11],選擇性使用多種混合凈化填料組合可以高效地去除多種雜質(zhì)。QuEChERS具備高效、簡便、綠色等優(yōu)點,近年來廣泛應(yīng)用于各檢測領(lǐng)域,也包括真菌毒素的分析[12-14]。將ASE和QuEChERS聯(lián)合使用,既能夠提高目標(biāo)化合物的萃取效率,又滿足了前處理操作簡便、快速的要求[15]。但是,目前還未見結(jié)合兩種技術(shù)應(yīng)用于藥食同源產(chǎn)品中多種真菌毒素檢測的報道。

本實驗采用加速溶劑萃取結(jié)合QuEChERS方法對藥食同源樣品中16種真菌毒素進(jìn)行萃取和凈化,采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行測定。該方法操作簡單,重復(fù)性好,靈敏度高,可用于藥食同源產(chǎn)品中多種真菌毒素的快速篩查和定量檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Nexera X2液相色譜儀(日本Shimadzu公司); QTrap 6500三重四極桿-線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜系統(tǒng)(美國AB Sciex公司); Allegra X-22R離心機(美國Beckman Coulter公司); ASE 350加速溶劑萃取儀(美國Thermo Fisher公司); R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司); N-EVAPTM112氮吹儀(美國Organomation Associates公司)。所有實驗室用水均由Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制得。

16種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品:DON(CAS號:51481-10-8,純度≥99.0% )、玉米赤霉烯酮(ZEN, CAS號:17924-92-4,純度≥99.9% )、3-乙?；撗跹└牭毒┐?3-AcDON, CAS號:50722-38-8,純度≥99.0% )、15-乙?；撗跹└牭毒┐?15-AcDON, CAS號:88337-96-6,純度≥99.0% )、黃曲霉毒素B1(AFB1, CAS號:1162-65-8,純度≥99.0% )、黃曲霉毒素B2(AFB2, CAS號:7220-81-7,純度≥99.9% )、黃曲霉毒素G1(AFG1, CAS號:1165-65-8,純度≥99.0% )、黃曲霉毒素G2(AFG2, CAS號:7241-98-7,純度≥98.3% )、伏馬毒素B1(FB1, CAS號:116355-83-0,純度≥99.7% )、伏馬毒素B2(FB2, CAS號:116355-84-1,純度≥99.9% )、OTA(CAS號:303-47-9,純度≥99.9% )、赭曲霉毒素B(OTB, CAS號:4825-86-9,純度≥99.0% )、疣孢青霉原(VER, CAS號:12771-72-1,純度≥98.0% )、雜色曲霉毒素(SMC, CAS號:10048-13-2,純度≥99.9% )、T-2毒素(T-2, CAS號:21259-20-1,純度≥98.2% )、HT-2毒素(HT-2, CAS號:26934-87-2,純度≥99.0% )、黃曲霉毒素B1內(nèi)標(biāo)(U-[13C17]-AFB1, CAS號:1217449-45-0, 0.5 mg/L)、伏馬毒素B1內(nèi)標(biāo)(U-[13C34]-FB1, CAS號:1217458-62-2, 25 mg/L)均購自美國Sigma公司;胺丙基鍵合硅膠(-NH2)、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、C18均購自上海安譜實驗科技股份有限公司;甲酸(色譜純,美國Fluka公司);乙酸(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙腈、甲醇(色譜純,美國Thermo Fisher公司)。山銀花、葛根、沙棘樣品均為市售。

1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液:分別準(zhǔn)確稱取適量各標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈-甲醇(3∶2, v/v)配制成含各真菌毒素100 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20 ℃下避光保存。

內(nèi)標(biāo)工作液:用乙腈將U-[13C17]-AFB1配制成質(zhì)量濃度為100 μg/L 的同位素內(nèi)標(biāo)工作液,U-[13C34]-FB1配制成質(zhì)量濃度為250 μg/L 的同位素內(nèi)標(biāo)工作液,于-20 ℃下避光保存。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:用空白樣品萃取液將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成適當(dāng)濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,并加入同位素內(nèi)標(biāo)溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

1.3.1 萃取

準(zhǔn)確稱取粉碎過篩后的樣品5.00 g,加入黃曲霉素B1同位素內(nèi)標(biāo)工作液和伏馬毒素B1同位素內(nèi)標(biāo)工作液各400 μL,然后加入1 g氯化鈉,并與適量硅藻土混勻后,移入34 mL不銹鋼樣品萃取池中進(jìn)行加速溶劑萃取。萃取試劑為乙腈-水-乙酸(85∶12∶3, v/v/v),萃取溫度75 ℃,加熱時間5 min,靜態(tài)萃取時間5 min,循環(huán)2次,沖洗體積為60%萃取池體積,萃取后氮氣吹掃100 s,收集萃取液于60 mL收集瓶中。最后將萃取液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中,于45 ℃水浴中減壓濃縮至近干,加入20 mL乙腈-水(85∶15, v/v)充分溶解殘渣,待凈化。

1.3.2 凈化

取上述待溶液5 mL于離心管中,加入0.6 g -NH2、0.4 g PSA、0.25 g C18,渦旋振蕩5 min。以 10 000 r/min 離心5 min,吸取1 mL上清液于室溫氮吹至近干,加入1 mL含0.1%(v/v)甲酸的乙腈-水(3∶97, v/v)復(fù)溶,過0.22 μm微孔濾膜,待上機。

1.4 分析條件

反相色譜柱:Kinetex XB-C18柱 (100 mm×3 mm, 2.6 μm,美國Phenomenex公司);柱溫:40 ℃;流動相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液(含5 mmol/L 乙酸銨), B為0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液;流速:0.4 mL/min。梯度洗脫條件:0～0.5 min, 3%B; 0.5～1.0 min, 3%B～10%B; 1.0～6.0 min, 10%B～90%B; 6.0～7.5 min, 90%B; 7.5～7.6 min, 90%B～3%B; 7.6～9.0 min, 3%B。進(jìn)樣體積:10 μL。

離子源:電噴霧電離(ESI)源,采用正、負(fù)離子同時掃描模式;噴嘴電壓:5 500 V(+)/-4 500 V(-);毛細(xì)管溫度:600 ℃;氣簾氣壓力0.207 MPa;碰撞氣電壓強度:medium。16種真菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件優(yōu)化

2.1.1 ASE條件優(yōu)化

16種真菌毒素的理化性質(zhì)差異較大,因此選擇一種兼容性好、萃取效率高的萃取溶劑尤為重要。本實驗在現(xiàn)有文獻(xiàn)[16-18]報道的基礎(chǔ)上,分別用乙腈、乙腈-乙酸體系和乙腈-水-乙酸體系作為萃取溶劑對空白山銀花樣品進(jìn)行加標(biāo)試驗(見圖1)。在pH值相同的情況下,當(dāng)萃取試劑中含有適量水時,大部分真菌毒素的萃取效率相比使用純乙腈時均有提高,這是因為水能夠增強乙腈的滲透能力,以便于萃取液滲透到基質(zhì)較為復(fù)雜的藥食同源性食品中,從而提高目標(biāo)物的萃取效率。此外,pH值對于部分酸敏感真菌毒素的萃取效率有較大影響,如DON、ZEN、OTA、FB1、FB2具有羧基基團(tuán),水溶性強,對有機萃取溶劑的酸度有一定要求,因此降低萃取液的pH值能提高其穩(wěn)定性,增加萃取效率。實驗進(jìn)一步對比了當(dāng)萃取液中含0% 、1% 、3% 和5%體積分?jǐn)?shù)的乙酸時的萃取效率。從圖1可以看出,隨著乙酸體積分?jǐn)?shù)的增加,部分真菌毒素的萃取效率有所增加,而當(dāng)萃取液中含有3%的乙酸時各目標(biāo)化合物的萃取效率相對較好。因此,實驗選擇乙腈-水-乙酸(85∶12∶3, v/v/v)作為萃取試劑。

表 1 16種真菌毒素及兩種同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of the 16 mycotoxins and two isotopic internal standards

CE: collision energy; DP: declustering potential; * quantitative ion.

圖 1 萃取液對加標(biāo)山銀花樣品中16種真菌毒素萃取效率的影響Fig. 1 Effect of extraction solvents on the extraction efficiencies of the 16 mycotoxins spiked in the flos lonicerae samples

萃取溫度考察了55、75、85和95 ℃ 4個溫度點。溫度增加可以降低萃取溶劑的黏度,從而提高溶劑對基質(zhì)的浸潤能力和對目標(biāo)物的溶解能力。但是溫度過高也可能導(dǎo)致目標(biāo)物產(chǎn)生不可預(yù)知的變化，從而影響最終的萃取效果。結(jié)果表明,當(dāng)萃取溫度為85 ℃和95 ℃時,各類毒素的回收率都有所減少。綜合考率,本實驗選擇75 ℃作為萃取溫度。

在循環(huán)次數(shù)上,循環(huán)2次與循環(huán)3次,結(jié)果沒有明顯的差異,為了減少樣品前處理的時間,選擇循環(huán)2次。

整個萃取過程大約用時20 min,得到的萃取液較為清澈,無需過濾直接進(jìn)行蒸發(fā)濃縮。

2.1.2 凈化填料的優(yōu)化

藥食同源性食品基質(zhì)較為復(fù)雜,且實驗采用高溫高壓萃取方式,在萃取目標(biāo)物化合物的同時也會萃取樣品中其他干擾物,如蛋白質(zhì)、色素、脂質(zhì)和糖類等,因此凈化步驟對于結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。凈化劑可以通過極性相互作用或非極性相互作用使目標(biāo)化合物和雜質(zhì)相互分離。本研究考察的凈化劑主要有C18、PSA、石墨化炭黑(GCB)、-NH2、氰丙基鍵合硅膠(-CN)、弗洛里硅土(Florisil)。在空白山銀花基質(zhì)中進(jìn)行添加回收試驗,各分析物的添加水平為10 μg/kg。分別考察了采用6種凈化劑單獨處理以及不同配比的凈化劑組合處理的凈化效果,比較各真菌毒素的回收率。結(jié)果表明,使用GCB時,黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮回收率較低。因為GCB對具有平面分子結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)具有顯著的吸附作用[19],但目標(biāo)化合物中黃曲霉毒素等毒素具有平面結(jié)構(gòu)或不完全平面分子結(jié)構(gòu),因此GCB不適于本研究。含有氰丙基鍵合硅膠和胺丙基鍵合硅膠等活性基團(tuán)的凈化劑可通過氫鍵作用吸附極性物質(zhì)(脂肪酸和有機酸等),實驗中發(fā)現(xiàn)-NH2能強烈吸附基質(zhì)中的極性色素,凈化非極性毒素。C18能夠吸附基質(zhì)中非極性物質(zhì),有效去除糖類,但凈化能力有限,加入PSA和-NH2后,各類真菌毒素的回收率都得到了提高,這與糖類、有機酸、脂肪酸等主要干擾物質(zhì)被去除后降低了基質(zhì)效應(yīng)的影響有關(guān)[20]。因此,本實驗最終采用C18、PSA和-NH2協(xié)同凈化的方式,增強雜質(zhì)的凈化能力,降低離子抑制作用,提高方法的準(zhǔn)確度。

2.2 超高效液相色譜條件優(yōu)化

實驗考察了2種色譜柱(Waters, ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)和Phenomenex, Kinetex XB-C18 (100 mm×3 mm, 2.6 μm))對16種真菌毒素分離效果的影響。結(jié)果表明:使用T3柱時,3-AcDON和15-AcDON這對同分異構(gòu)體無法達(dá)到基線分離,且峰形較差,響應(yīng)較低。而使用Phenomenex Kinetex XB-C18柱則能達(dá)到較好的分離效果。該柱內(nèi)徑和填料粒徑均較小,能夠獲得良好的分離度。

由于真菌毒素易溶于甲醇或乙腈,實驗還分別考察了甲醇和乙腈作為強洗脫流動相的洗脫效果。當(dāng)乙腈-水體系作為流動相時,在正、負(fù)兩種模式下的洗脫效果和響應(yīng)強度均好于甲醇-水體系,這有可能是因為少數(shù)待測物中含有乙酰氧基團(tuán),而此類化合物在甲醇中不穩(wěn)定。因此,實驗選擇乙腈作為強洗脫流動相。在流動相中加入0.1%(v/v)的甲酸可以提高待測物在電噴霧電離、正離子模式中的離子化效率,提高靈敏度。當(dāng)使用0.1%(v/v)甲酸水和0.1%(v/v)甲酸乙腈進(jìn)行梯度洗脫時,AFG2存在嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象,而在水相中加入少量的乙酸銨能消除這種現(xiàn)象。為了增大目標(biāo)化合物的響應(yīng)值并且改善峰形,實驗進(jìn)一步考察了不同濃度的乙酸銨對目標(biāo)化合物離子化效率的影響。結(jié)果表明,在水相中加入5 mmol/L 乙酸銨能夠最大限度增加目標(biāo)化合物的響應(yīng)值并改善峰形,而過高濃度的乙酸銨反而會降低目標(biāo)化合物的離子化效率。所以實驗最終選擇含5 mmol/L 乙酸銨的0.1%(v/v)甲酸水溶液和0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液作為流動相。由于藥食同源性食品基質(zhì)較為復(fù)雜且分析物較多,實驗選擇梯度洗脫進(jìn)行分析以達(dá)到縮短出峰時間和高效除去色譜柱中殘留雜質(zhì)的目的。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在優(yōu)化質(zhì)譜采集參數(shù)時,同時考察了16種真菌毒素在正、負(fù)離子模式下的響應(yīng)值,發(fā)現(xiàn)除了ZEN在負(fù)模式下響應(yīng)較好,其余的15種目標(biāo)物均在正離子模式下響應(yīng)較好。除了T-2的母離子為[M+NH4]+峰,其余15種化合物在選定的分析條件下都產(chǎn)生[M+H]+峰。在MRM分析中選擇了離子豐度最高的子離子作為定量離子,離子豐度次高的作為定性離子,并且優(yōu)化了CE值和DP值,以獲得較高的響應(yīng)值。各化合物的提取離子流色譜圖見圖2。

圖 2 16種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品及同位素內(nèi)標(biāo)的提取離子流色譜圖Fig. 2 Extracted ion current chromatograms of the 16 mycotoxins and the isotope internal standards

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

由于AFB1和FB1的穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)試劑易獲得,實驗中AFB1和FB1用內(nèi)標(biāo)法定量,其余毒素用外標(biāo)法定量。

在空白山銀花樣品基質(zhì)中添加目標(biāo)化合物,分別加入100 μL AFB1和FB1的同位素內(nèi)標(biāo)工作液,配制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。AFB1和FB1以其與同位素內(nèi)標(biāo)響應(yīng)峰面積之比為縱坐標(biāo)(Y′),其余14種化合物以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),分別以對應(yīng)的質(zhì)量濃度(X, μg/L)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍和10倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。

如表2所示,16種真菌毒素在各自的線性范圍內(nèi)線性良好,線性相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。16種真菌毒素的檢出限為0.008～0.3 μg/kg,定量限為0.03～1.0 μg/kg,遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)對真菌毒素限量檢測要求和歐盟、日本等國家規(guī)定的最大殘留量。

表 2 16種真菌毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r2), LODs and LOQs of the 16 mycotoxins

Y: peak area;Y′: peak area ratio of the analyte to isotope internal standard;X: mass concentration, μg/L.

2.4.2 加標(biāo)回收率和精密度

分別用山銀花、葛根、沙棘空白樣品作為基質(zhì),添加3個不同水平的待測物,平行測定6次,計算回收率以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。可以看出,16種真菌毒素的平均回收率為70.8% ～118% ,使用內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)后,AFB1和FB1的回收率更高，可達(dá)90%以上；RSD為2.5% ～10.2% ,滿足檢測要求。

表 3 16種真菌毒素在3種基質(zhì)中的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviation (RSDs) of the 16 mycotoxins spiked in three matrices (n=6)

表 3 (續(xù))Table 3 (Continued)

2.5 實際樣品檢測

采用建立的方法分別對電商銷售的30個批次的山銀花、葛根和沙棘進(jìn)行16種真菌毒素的殘留量測定。

結(jié)果表明，1個批次的沙棘樣品和1個批次的葛根樣品被檢出含有AFB1,污染水平分別為3.59 μg/kg 和6.17 μg/kg。1個批次的沙棘樣品被檢出含有AFG2,污染水平高達(dá)11.7 μg/kg。1個批次的山銀花樣品被檢出含有OTA,污染水平為7.45 μg/kg。2個批次的沙棘樣品和1個批次的葛根樣品被檢出含有FB1,污染水平為52.6～96.9 μg/kg。其余真菌毒素均未檢出。

3 結(jié)論

本文建立了一種基于ASE和QuEChERS聯(lián)用的前處理技術(shù),結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測藥食同源性食品中16種真菌毒素的檢測方法。與傳統(tǒng)方法相比,本方法減少了有機溶劑用量,縮短了檢測周期,提高了檢測靈敏度,檢出限、定量限遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)對真菌毒素限量檢測要求和歐盟、日本等國家規(guī)定的最大殘留量。方法學(xué)考察及實際樣品檢測證明,該方法具有實用性強、靈敏度高、操作簡便快速等優(yōu)點,能夠滿足國內(nèi)外對植物源性藥食同源產(chǎn)品中多種真菌毒素的檢測要求。