劉 雪，管軍軍，朱 浩，冀旭陽，鄭建樟，路新

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

目前，大豆分離蛋白(Soy protein isolate，SPI)因蛋白含量極高而應(yīng)用十分廣泛，其營養(yǎng)價值豐富，含多種氨基酸，是一種優(yōu)質(zhì)的植物水溶性蛋白。大豆分離蛋白的組成和結(jié)構(gòu)決定了其功能特性，它的乳化特性在食品加工方面得到了很好的應(yīng)用，除此之外它還具有良好的發(fā)泡性、溶解性和凝膠性[1]。大豆分離蛋白有親水和親油兩種基團，這兩種基團可以吸附在油-水界面，阻止油滴或者是水滴相互聚集，通過降低油-水界面的表面張力而形成穩(wěn)定的乳狀液，是良好的表面活性劑。另外，有研究表明，在乳液中添加磷脂可以增加大豆分離蛋白的熱穩(wěn)定性[2]。磷脂作為一種兩性表面活性劑，其疏水區(qū)和片層結(jié)構(gòu)能夠與蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)相互作用，對蛋白的表面結(jié)構(gòu)和電荷分布產(chǎn)生影響，降低乳液界面張力，增強乳液穩(wěn)定性能[3]。因此，大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液作為穩(wěn)定載體得到了很好的應(yīng)用，且成分簡單、易于分析。

枯草芽孢桿菌是目前應(yīng)用較廣泛的益生菌之一，可在很極端的條件下復(fù)蘇繁殖。枯草芽孢桿菌在胃腸道中復(fù)蘇增殖的過程中會利用機體蛋白和碳水化合物來完成自身生長繁殖，但其代謝產(chǎn)物如蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等可降解食物中復(fù)雜的營養(yǎng)物質(zhì)，從而提高機體消化率[4-5]。另外，枯草芽孢桿菌還可通過營養(yǎng)調(diào)控來改善腸道功能、維持腸道健康, 對動物產(chǎn)生一系列的益生作用[6]。因此，枯草芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，尤其是食品工業(yè)，但其對營養(yǎng)成分的具體作用機制仍比較模糊，還有待研究。

由于動物試驗成本太高，試驗結(jié)果受到動物個體差異等因素的影響，所以通過體外模擬口腔、胃消化過程來進行大豆蛋白磷脂-復(fù)合乳液的消化試驗。胃腸消化過程是一個動態(tài)的過程，既有化學(xué)作用也有物理作用，通過模擬胃的溫度、胃的蠕動和胃液的分泌時間等研究乳液在消化過程中結(jié)構(gòu)的變化[7]。動態(tài)消化模型技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品健康和營養(yǎng)的研究中，對食品工業(yè)的發(fā)展具有重要意義[8]。

本試驗以大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液為研究對象，探討了枯草芽孢桿菌在胃消化過程中對其穩(wěn)定性的影響，對促進益生菌和大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液的應(yīng)用等方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆：鄭州丹尼斯超市；大豆油(金龍魚精煉一級)：益海嘉里食品營銷有限公司；粉末磷脂(丙酮不溶物含量≥98%)：鄭州四維科技有限公司；α-淀粉酶：盈芯生物科技(上海)有限公司；胃蛋白酶：活性 10 000 NFU/mg，生工生物工程(上海)股份有限公司；枯草芽孢桿菌BS-GA15：潤盈生物工程(上海)有限公司；磷酸二氫鉀(≥99.5%)、氯化鎂(≥98%)等：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

ZS90型納米粒度及Zeta 電位分析儀：英國馬爾文儀器有限公司；FA25 高剪切分散乳化機：德國FLUKO 公司；HH-4型恒溫水浴鍋：河南智城科技發(fā)展有限公司；722 N可見分光光度計：上海精科實業(yè)有限公司；BH200生物顯微鏡：舜宇光學(xué)科技集團有限公司；DSX-30 L型高壓蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 大豆分離蛋白(SPI)的制備

參考文獻[9-10]的方法，略作修改。精選大豆粉碎后過60目篩得大豆粉，于索氏抽提儀中用石油醚脫脂。所得脫脂豆粉與蒸餾水(1∶10)混合置于磁力攪拌器中室溫下攪拌1 h，之后用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值到8.0，將所得溶液置于60 ℃水浴中繼續(xù)攪拌1 h，加速其溶解。然后離心(5 000 r/min)30 min,取上清液后用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至4.8后4 ℃冷藏過夜。次日繼續(xù)離心(5 000 r/min)30 min，取下層沉淀冷凍干燥，可得酸性SPI，將所得SPI置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液體系的構(gòu)建及制備方法

參考江連洲等[11-12]的研究結(jié)果,設(shè)計正交試驗來確定較穩(wěn)定的乳液體系，利用濁度法衡量乳狀液的穩(wěn)定狀態(tài)。取一定量的蛋白溶于蒸餾水中，用NaOH(2 mol/L)調(diào)節(jié)pH值到7.0，高速剪切分散乳化機(21 000 r/min)乳化60 s。稱適量磷脂加熱溶解于大豆油中，乳化60 s。然后將二者混合，再乳化120 s可得大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液。將制備好的乳狀液迅速倒入已編號的10 mL試管(表1)中，靜置24 h。另外，在瓶底取20 μL乳狀液于試管中，用10 mL 0.1%SDS溶液稀釋混勻, 在500 nm處測定稀釋液的吸光度A0，靜置30 min后測得吸光度為A30，參照Pearce等[13]的方法，乳化穩(wěn)定指數(shù)(Emulsification stability index，ESI)表示為:

表1 不同編號的大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液中的各成分配比

1.3.3 枯草芽孢桿菌菌液的制備

將實驗室自制的枯草芽孢桿菌菌粉在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液[14](0.5 g牛肉膏、1 g蛋白胨、0.5 g NaCl)中培養(yǎng)24 h后用平板涂布法進行純化，將純化的單一菌落取出，液體培養(yǎng)12 h后低溫保存?zhèn)溆?。此時活菌數(shù)約4×107CFU/mL。

1.3.4 胃液和唾液的制備

按照文獻[15-16]配制唾液和胃液。唾液和胃液的配方見表2，按照配方將各物質(zhì)(唾液淀粉酶和胃蛋白酶使用前加入)加入500 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容,作為母液備用。

表2 唾液和胃液的各成分及濃度

注：*表示用HCl將胃液pH值調(diào)至2。

1.3.5 模擬胃動態(tài)消化模型的建立

參考文獻[16-17]建立胃動態(tài)消化模型。取100 mL乳液和7 mL枯草芽孢桿菌液加到錐形瓶中混勻[18]。再在混合好的溶液里加入100 mL含淀粉酶的唾液，37 ℃攪拌5 min來模擬乳液在口腔中的消化。用輸液器模擬胃液的連續(xù)分泌，稱取0.05 g胃蛋白酶加到200 mL胃液母液中，混勻后裝入輸液瓶，調(diào)置輸液管滴速為1.7 mL/min，用水浴振蕩的方式模擬胃的運動,轉(zhuǎn)速為60 r/min，持續(xù)轉(zhuǎn)動4 h。取樣時，為消除胃液稀釋帶來的誤差，要保證各時間點取樣的大豆蛋白含量相同，在每次取樣后立即進行相關(guān)指標(biāo)的測定，試驗重復(fù)3次。

1.3.6 顯微觀察

取樣后立即吸取20 μL樣品均勻涂于兩張載玻片上，一張直接在顯微鏡下用16×40倍鏡觀察乳液形態(tài)并拍照。另一張烘干固定枯草芽孢桿菌，用革蘭染色法對其染色后在顯微鏡下觀察形態(tài)及分布。

1.3.7 乳液濁度的測量

取出的樣品用0.1% SDS稀釋不同的倍數(shù)以保證吸光度的數(shù)值在0.2～0.8之間。在500 nm波長處用紫外分光光度計測量樣品的吸光度A，濁度表示為[19]:

式中：A為吸光度；V為稀釋倍數(shù)；I為光誤差1 cm。

1.3.8 粒徑和 Zeta電位的測量

參考Chanamai等[20]的方法，稍作改動。按時間點取樣后用蒸餾水稀釋500倍,取適量稀釋液于樣品槽中，將儀器測定溫度設(shè)置為25 ℃。粒徑的乳液相對折射率設(shè)置為1.095(大豆油(1.456)與水相(1.33)的折射率之比)。單個樣品的粒徑與電位的測量次數(shù)為3次，取3次測量結(jié)果的平均值。

1.3.9 活菌數(shù)的測定

在加菌的試驗中每隔1 h取一次樣，參照王斌等[21]的方法，準(zhǔn)備7個裝有9 mL無菌水的試管，取1 mL乳液放入第一支試管中，之后分梯度稀釋，取1 mL 10-5、10-6、10-7梯度的稀釋液在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中進行平板涂布，37 ℃下培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

每組試驗重復(fù)3次，試驗所得的數(shù)據(jù)先用Excel進行初步整理，然后用SAS軟件進行單因素和多因素方差分析，P<0.05為差異顯著，用Origin9.1軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 O/W型和W/O型大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液體系的確定

由圖1可以看出，各濃度乳液經(jīng)24 h靜置，外觀沒有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的破乳現(xiàn)象，可根據(jù)圖2乳化穩(wěn)定指數(shù)(ESI)進一步分析。圖2顯示，4號O/W型和6號W/O型乳液的ESI值較高，分別為97.57%和96.66%，說明乳液穩(wěn)定性較好，可滿足試驗要求。由表1可知，4號乳液含1.96%蛋白，0.20%磷脂，19.57%大豆油，屬于O/W型乳液，6號乳液含1.96%、0.10%磷脂、58.77%大豆油，屬于W/O型乳液。

圖1 不同濃度的大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液隨時間變化的外觀

圖2 不同濃度的大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液的乳化穩(wěn)定指數(shù)

2.2 乳液的濁度分析

由圖3A可以看出，隨著消化時間的延長，不加菌O/W型乳液的濁度從161.412±8.650降到24.623±2.263，而加菌乳液的濁度從160.249±9.546降到10.102±0.141，兩者均在30～120 min急劇降低(P<0.05)，且都在120 min后趨于穩(wěn)定。隨著胃液的不斷增加，胃蛋白酶含量升高，乳液pH值降低，30 min后胃蛋白酶對乳液作用增強，降解了大量的大豆蛋白，嚴(yán)重破乳，油滴聚集上浮，濁度降低。Somruedee等[22]的研究顯示，酶解之后的蛋白降解為小肽，疏水性基團被破壞，不能像大分子量的蛋白一樣降低油-水界面的表面張力。由圖3B可以看出，W/O型不加菌乳液的濁度在10 min內(nèi)從784.525±34.654上升到1 068.745±54.832，之后顯著降低至53.916±4.832，而加菌乳液濁度在5 min內(nèi)達到峰值，從776.247±5.348上升到975.831±60.952，之后降至29.453±1.128。根據(jù)付笑飛等[23]的研究結(jié)果，W/O型大豆蛋白磷脂復(fù)合乳液在酶解過程中有二次乳化的現(xiàn)象，即從W/O型轉(zhuǎn)化為O/W型的過程。W/O型乳液前期濁度升高，也可能是因加唾液而破乳上浮的油滴發(fā)生了二次乳化。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，加菌對于乳液變化影響更顯著(P<0.01)，由圖3可知，加菌之后，O/W型和W/O型乳液的整體濁度比不加菌的低，且在W/O乳液的反應(yīng)中二次乳化和劇烈破乳的時間點提前，說明枯草芽孢桿菌可能與胃蛋白酶相互作用，促進了乳液破乳。

注：小寫字母表示不同消化時間點間的差異性,圖4、圖7、圖8同。

2.3 平均粒徑及顯微觀察分析

大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液在消化過程中會出現(xiàn)分離、聚合、聚集等現(xiàn)象，粒徑是用來衡量液滴的聚集程度[24]。圖4反映的是乳液在不同消化時間點的平均粒徑，結(jié)合圖5、圖6乳液的油滴形態(tài)圖進行分析。由圖4A可以看出，O/W型乳液的平均粒徑隨消化時間延長逐漸增加后趨于平穩(wěn)，不加菌乳液從(628.87±11.85) nm增加到(2 030.67±84.72) nm，而加菌乳液從(519.25±18.37) nm增加到(2 004.23±113.45) nm。圖5也顯示隨著消化時間延長乳液的液滴逐漸增大，說明O/W型乳液的整個消化過程，液滴的聚合現(xiàn)象都多于分離現(xiàn)象。圖4B顯示，W/O型乳液的平均粒徑變化較O/W型復(fù)雜，加菌乳液的平均粒徑在前5 min稍降低至(1 143.52±26.16) nm后升高，20 min后再次下降，60 min時降到最低值(936.43±16.05) nm，不加菌乳液的平均粒徑則前10 min降低至(1 172.54±62.34) nm后升高，30 min后再降低，90 min降至最低值(1 026.35±35.07) nm。但圖6顯示的液滴在逐漸變大，密度減小，W/O型乳液消化前期存在明顯的聚集現(xiàn)象。W/O型乳液的平均粒徑第一次降低，可能發(fā)生了二次乳化變成O/W乳液。隨著胃液的不斷加入，水相增多，乳液液滴分散不均勻成簇聚集，使測得的粒徑增大。當(dāng)胃液繼續(xù)滴加，乳液液滴分散開，此時胃蛋白酶也起主導(dǎo)作用，大量蛋白開始被降解，油滴分離，大分子量的油滴聚集上浮，小分子量的油滴與小分子蛋白或降解的多肽結(jié)合。這一過程乳液的分離現(xiàn)象多于聚合現(xiàn)象，粒徑減小，大分子量的油滴聚集上浮后很難再次被乳化，分離現(xiàn)象減弱，形成的小分子液滴聚合加快，粒徑增大。

由圖4可知，加菌乳液的整體平均粒徑要低于不加菌乳液的，且差異顯著(P<0.05)。從圖5、圖6也發(fā)現(xiàn)在相同時間點A的液滴直徑略大于B。綜上所述，枯草芽孢桿菌可能直接或間接地破壞了大豆蛋白和磷脂，使其分子量減小，乳化性能較不加菌的低，則形成的乳液液滴也就偏小。

圖4 不同消化時間下乳液平均粒徑的變化

(A1—A4為不加菌乳液油滴形態(tài)圖；B1—B4為加菌乳液油滴形態(tài)圖；0 min、60 min、120 min、240 min表示消化時間)

(A1—A4為不加菌乳液油滴形態(tài)圖；B1—B4為加菌乳液油滴形態(tài)圖；0 min、20 min、30 min、60 min、90 min、240 min表示消化時間)

2.4 Zeta電位分析

乳液液滴和分散溶液之間的電位差表示液滴之間的排斥力大小,排斥力越大，越不容易聚合，穩(wěn)定性越好[25]。由圖7A可以看出，O/W型加菌與不加菌乳液的初始電位分別為(-45.24±1.79) mV、(-52.10±2.19) mV，均為負值，隨著胃液的滴加，電位逐漸增加至(-1.23±0.40) mV、(-5.13±0.31) mV。胃液中含有大量的H+，可以不斷地中和乳液中的陰離子，減小液滴之間的排斥力，促進液滴聚合，表面帶電荷減少，電位增加。由圖7B可以看出，W/O型不加菌乳液的電位在前10 min從(-58.12±2.14) mV下降至(-65.38±0.75) mV，加菌乳液則在前5 min從(-52.14±2.41) mV減小到(-57.66±2.47) mV，兩者均在120 min后趨于穩(wěn)定，240 min時電位分別為(-4.91±0.27) mV、(-0.49±0.04) mV。無論加菌與不加菌W/O型乳液的電位值在消化前期都在減小，應(yīng)該還是乳液二次乳化的轉(zhuǎn)向過程，結(jié)合圖3B、圖4B，可知此時濁度增大，粒徑減小，則液滴表面積增大，電位降低。從整體來看，加菌乳液的電位要大于不加菌乳液的電位，說明枯草芽孢桿菌對乳液電位的變化也有影響。一方面，枯草芽孢桿菌可能是通過破壞蛋白或磷脂來加快破乳，間接促進電位增加；另一方面，枯草芽孢桿菌可能代謝產(chǎn)酸,加劇了乳液的聚合現(xiàn)象，電位升高[26]。

圖7 不同消化時間下乳液電位的變化

2.5 活菌數(shù)檢測結(jié)果分析

由圖8、圖9的活菌數(shù)和顯微圖片可以看出，枯草芽孢桿菌在大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液的消化過程中進行了生長代謝，在120 min之前O/W型乳液的菌數(shù)從(1.09±0.02)×106CFU/mL呈線性增加至(27.06±0.65)×106CFU/mL，而W/O型乳液的菌數(shù)從(1.23±0.10)×106CFU/mL增加至(29.06±0.57)×106CFU/mL，兩者均在180 min后無顯著性變化。菌的生長代謝需要消耗營養(yǎng)物質(zhì)，尤其是碳水化合物和蛋白質(zhì)，通過活菌數(shù)、乳液濁度、電位、粒徑的變化分析可知，枯草芽孢桿菌可能利用了乳液中的大豆蛋白促進自身繁殖，加劇了乳液的破乳現(xiàn)象。另外，根據(jù)李怡浩等[4]研究，枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶，同時可以促進胃腸道消化酶的活性。因此，菌可以加速破乳的現(xiàn)象也可能是菌代謝產(chǎn)物作用的結(jié)果。經(jīng)分析，枯草芽孢桿菌在O/W型乳液和W/O型乳液中的生長趨勢差異不顯著(P=0.973 7>0.05)，說明大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液的類型對枯草芽孢桿菌的生長無顯著性影響。

圖8 不同消化時間下枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)

(A1—A4為O/W型乳液菌的形態(tài)及分布圖；B1—B4為W/O型乳液菌的形態(tài)及分布圖；0 min、60 min、120 min、240 min表示消化時間)

3 結(jié)論

O/W型大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液在酶解消化過程中聚合現(xiàn)象多于分離。加菌乳液與不加菌乳液相比，濁度降低(P<0.05)，電位升高(P<0.05)，粒徑減小(P<0.05)。W/O型乳液中油脂含量高，在酶解消化過程中有聚合現(xiàn)象多于分離現(xiàn)象的時間段和分離現(xiàn)象多于聚合現(xiàn)象的時間段，所以粒徑變化復(fù)雜，但對濁度、電位影響不大。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，加菌對W/O型乳液的影響同O/W型乳液的一樣，差異顯著(P<0.05)?？莶菅挎邨U菌對大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液的消化有顯著影響，后續(xù)研究可進一步探究枯草芽孢桿菌對乳液的作用機理。