梁少華，魏賢之，張 曼，孫 聰

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

中鏈甘油三酯(Medium Chain Triglyceride，簡稱MCT)是指甘油骨架上連接3個(gè)中鏈脂肪酸(Medium Chain Fatty Acid，簡稱MCFA，C6～12)而構(gòu)成的甘油三酯[1]。MCT因其良好的抗氧化性及對維生素類、殺菌劑和抗生素類物質(zhì)良好的溶解性，可以在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用作藥物溶劑[2]。MCT能夠在很短的時(shí)間內(nèi)供能，可作為需要快速補(bǔ)充能量的特殊人群的有效功能來源[3]。MCT具有中等碳鏈的結(jié)構(gòu)，可作為奶制品、飲料制品等的乳化劑和穩(wěn)定劑[4]。MCT與其他乳化劑混合使用時(shí)，互溶性和穩(wěn)定性較好，可用作化妝品的保濕劑和穩(wěn)定劑[5]。

目前MCT的制備方法主要分為化學(xué)法催化和酶法催化[6-7]?；瘜W(xué)法催化采用的催化劑價(jià)格較低，工藝成熟，容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，但其隨機(jī)性強(qiáng)，往往伴隨副反應(yīng)[8]。酶法催化副產(chǎn)物較少，產(chǎn)品容易分離，缺點(diǎn)在于耗時(shí)長、價(jià)格高，無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)[9]。仝瑩瑩[10]利用酸性離子液體作為催化劑，催化MCFA和甘油酯化合成MCT，最優(yōu)條件下甘油三酯得率達(dá)92.90%。Ghosh等[11]以椰子油和辛酸甲酯、癸酸甲酯為原料，分別用化學(xué)法催化和酶法催化制備MCT，結(jié)果表明化學(xué)法催化時(shí)產(chǎn)物中辛酸和癸酸含量較高，為25%～28.3%。

椰子油中MCFA含量遠(yuǎn)超大豆油、花生油等，是制備MCT的優(yōu)質(zhì)原料[12]。因此，本研究以椰子油和辛酸為原料，在濃硫酸催化作用下進(jìn)行酸解反應(yīng)制備富含MCT的產(chǎn)品，并對其工藝條件進(jìn)行探索和優(yōu)化，對深度開發(fā)椰子油資源和MCT的制備具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

椰子油：印度尼西亞米南伽奧甘農(nóng)業(yè)公司；辛酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%)：連云港豐益油脂科技有限公司；濃硫酸：洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；三辛酸甘油酯、三癸酸甘油酯：西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；豬胰脂酶：實(shí)驗(yàn)室自制。

正己烷、乙腈、異丙醇為色譜純；正己烷、乙醚、冰乙酸、酚酞、碘化鉀、硅膠GF254、2,7-二氯熒光素、羧甲基纖維素鈉等均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Sartorius BSA224S型分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；DF-101 K集熱式恒溫磁力攪拌器：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；7890 A型氣相色譜儀：美國Agilent 公司；E2695型高效液相色譜儀：美國Waters公司；ZF-4型四用紫外分析儀：上海嘉鵬科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 椰子油和辛酸酸解反應(yīng)

在三口燒瓶中加入一定量的椰子油和辛酸，恒溫磁力攪拌油浴鍋內(nèi)預(yù)熱，溫度穩(wěn)定后添加一定量的催化劑，密閉反應(yīng)容器，至預(yù)定時(shí)間結(jié)束反應(yīng)，取樣水洗除去催化劑，真空干燥脫水，密封保存。

1.3.2 甘油三酯的分離

將產(chǎn)物進(jìn)行薄層色譜分離，展開劑為正己烷-乙醚-冰乙酸 (體積比為80∶20∶2)，使用2,7-二氯熒光劑溶液噴霧并在紫外(254 nm)下顯色。刮下甘油三酯帶，乙醚萃取后用氮?dú)獯蹈桑M(jìn)一步分析。

1.3.3 脂肪酸組成分析

按照GB/T 17376—2008制備脂肪酸甲酯；脂肪酸甲酯的氣相色譜分析按照GB/T 17377—2008方法分析。

測定條件：色譜柱為SGE BPX-70，進(jìn)樣口溫度210 ℃，F(xiàn)ID檢測器，檢測器溫度300 ℃，N2流速1.0 mL/min，H2流速40 mL/min，空氣流速400 mL/min。

1.3.4sn-2位脂肪酸組成分析

取約50 mg甘油三酯，加入Tris緩沖液(pH 8.0，1 mL)、膽酸鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%，0.25 mL)、CaCl2(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.2%，0.1 mL)和豬胰脂酶(10 mg)。水浴(40 ℃)中劇烈振蕩3 min，然后加入1 mL HCl溶液(6 mol/L)和2 mL乙醚振蕩后離心。使用無水硫酸鈉干燥，用氮吹濃縮。在薄層色譜板上分離水解產(chǎn)物，展開劑為正己烷-乙醚-乙酸(體積比為50∶50∶1)，使用2,7-二氯熒光劑溶液噴霧并在紫外(254 nm)下顯色。刮下對應(yīng)的sn-2位甘油一酯的條帶，用正己烷萃取，甲酯化后用氣相色譜儀分析。

1.3.5 甘油三酯組成分析

稱取50 mg甘油三酯于10 mL離心管內(nèi)，加入3 mL異丙醇，漩渦振蕩溶解，過0.22 μm有機(jī)濾膜，采用高效液相色譜儀-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)分析甘油三酯組成。

HPLC-ELSD測定條件[13]：C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-異丙醇(B)，柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min，ELSD霧化室溫度55 ℃，氮?dú)饬魉?.8 L/min。A的梯度洗脫條件：0 min，70%；30 min，60%；70 min，55%；75 min，70%；76 min，70%。進(jìn)樣量10 μL。

1.3.6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究首先對反應(yīng)溫度、底物物質(zhì)的量比(n辛酸∶n椰子油)、催化劑濃硫酸添加比例(按椰子油質(zhì)量計(jì))和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Box-Benhnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件，以產(chǎn)物中MCFA含量為響應(yīng)值，對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)中各水平的試驗(yàn)結(jié)果取2次平行試驗(yàn)的均值。使用IBM SPSS Statistics 20軟件對單因素試驗(yàn)獲得的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定具有顯著性差異的水平。然后利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行回歸分析，得到與各評價(jià)指標(biāo)相關(guān)的多項(xiàng)回歸方程和方差分析結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 椰子油的組成分析

椰子油的脂肪酸組成及分布如表2所示，測定結(jié)果與之前的研究相近[14-15]。椰子油中MCFA含量為52.61%。在sn-2位脂肪酸分布中，月桂酸含量為73.95%，未檢測到辛酸，癸酸含量為2.58%，sn-2位MCFA總量高達(dá)76.53%。

采用HPLC-ELSD分析椰子油的甘油三酯組成，結(jié)果如表3所示。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間可知，椰子油甘油三酯的當(dāng)量碳數(shù)在30～42之間，當(dāng)量碳數(shù)30～36的甘油三酯既有可能為中鏈甘油三酯，也可能為中長鏈甘油三酯[13]。當(dāng)量碳數(shù)38～42的甘油三酯為中長鏈甘油三酯。結(jié)合Bezard等[16]的研究，當(dāng)量碳數(shù)為30、32、34和36的甘油三酯中MCT含量分別為84%、79%、30%和52%，因此試驗(yàn)所用椰子油中MCT含量為33.07%。

表2 椰子油脂肪酸組成及位置分布

注：-表示未檢出；sn-1,3位脂肪酸組成根據(jù)1,3-隨機(jī)-2-隨機(jī)理論計(jì)算。

表3 椰子油甘油三酯組成及含量

綜上所述，椰子油是用于制備富含MCT油脂產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)原料。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 反應(yīng)時(shí)間對產(chǎn)物中甘油三酯脂肪酸及sn-2位脂肪酸含量的影響

在反應(yīng)溫度90 ℃、底物物質(zhì)的量比4∶1、催化劑添加比例3%的條件下，考察反應(yīng)時(shí)間對試驗(yàn)的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 反應(yīng)時(shí)間對產(chǎn)物中甘油三酯脂肪酸及sn-2位脂肪酸含量的影響

由圖1可知，在2～6 h，辛酸含量和MCFA含量增加較顯著，反應(yīng)6 h時(shí)，基本達(dá)到平衡狀態(tài)，產(chǎn)物中辛酸含量為29.60%，相比椰子油增加了24.14個(gè)百分點(diǎn)；MCFA含量為64.37%，相比椰子油增加了11.76個(gè)百分點(diǎn)。產(chǎn)物中sn-2位辛酸含量的變化與辛酸含量變化趨勢相似，反應(yīng)6 h時(shí)，sn-2位辛酸含量達(dá)到平衡(29.24%)，相比椰子油增加了29.24個(gè)百分點(diǎn)，此時(shí)sn-2位MCFA含量為66.25%，相比椰子油略有下降，sn-2位MCFA含量在整個(gè)反應(yīng)階段變化不明顯。

造成這種現(xiàn)象的原因可能是反應(yīng)開始時(shí)，底物濃度較高，反應(yīng)速率較快，產(chǎn)物中辛酸、MCFA含量不斷增加，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，底物濃度不斷降低，反應(yīng)速率下降，反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài)[17]。sn-2位MCFA含量則在整個(gè)反應(yīng)過程中略低于原料油中的含量，原因可能在于與酶法催化的專一性不同，化學(xué)法催化具有隨機(jī)性的特點(diǎn)[18]?？紤]到試驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)性和有效性，反應(yīng)時(shí)間以6 h為宜。

2.2.2 反應(yīng)溫度對產(chǎn)物中甘油三酯脂肪酸及sn-2位脂肪酸含量的影響

在底物物質(zhì)的量比4∶1、催化劑的添加比例3%、反應(yīng)時(shí)間6 h的條件下，考察反應(yīng)溫度對試驗(yàn)的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 反應(yīng)溫度對產(chǎn)物中甘油三酯脂肪酸及sn-2位脂肪酸含量的影響

由圖2可知，在所選溫度范圍內(nèi)，辛酸含量、MCFA含量隨溫度的升高而上升，反應(yīng)溫度由70 ℃上升到90 ℃，辛酸含量增加到40.38%；MCFA含量增加到76.19%，基本達(dá)到平衡狀態(tài)。繼續(xù)升高反應(yīng)溫度至120 ℃，辛酸及MCFA含量增長幅度較低。產(chǎn)物中sn-2位辛酸含量在所選溫度范圍內(nèi)隨溫度的升高而呈現(xiàn)上升趨勢，在120 ℃時(shí)達(dá)到最大值41.40%，而sn-2位MCFA含量在所選溫度范圍內(nèi)變化不大。

隨著反應(yīng)溫度的升高，反應(yīng)底物中脂質(zhì)黏度降低，同時(shí)底物分子的熱運(yùn)動(dòng)加快，導(dǎo)致產(chǎn)物中MCFA含量增加。過高的反應(yīng)溫度會增加?；粨Q的速率，也會導(dǎo)致底物碳化等副反應(yīng)的發(fā)生，所以濃硫酸催化辛酸酸解椰子油反應(yīng)的適宜溫度選擇90 ℃[19-20]。

2.2.3 底物物質(zhì)的量比對產(chǎn)物中甘油三酯脂肪酸及sn-2位脂肪酸含量的影響

在反應(yīng)溫度90 ℃、反應(yīng)時(shí)間6 h、催化劑添加比例3%條件下，研究底物物質(zhì)的量比對試驗(yàn)的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 底物物質(zhì)的量比對產(chǎn)物中甘油三酯脂肪酸及sn-2位脂肪酸含量的影響

由圖3可知，隨著底物物質(zhì)的量比的增加，產(chǎn)物中辛酸、MCFA含量出現(xiàn)先升高后趨于穩(wěn)定的趨勢，在底物物質(zhì)的量比為4∶1時(shí)，反應(yīng)基本達(dá)到平衡，產(chǎn)物中的辛酸、MCFA含量分別為25.04%和62.46%，相比椰子油依次增長了19.58個(gè)百分點(diǎn)和9.85個(gè)百分點(diǎn)。產(chǎn)物中sn-2位辛酸含量也在底物物質(zhì)的量比為4∶1時(shí)達(dá)到平衡，其含量為23.02%，比椰子油增長了23.02個(gè)百分點(diǎn)，此時(shí)sn-2位MCFA含量為69.78%，略低于椰子油的76.53%。

底物物質(zhì)的量比小于4∶1時(shí)，反應(yīng)物中的辛酸含量相對較少，影響了濃硫酸的催化效果和目標(biāo)產(chǎn)品的生成；底物物質(zhì)的量比高于4∶1時(shí)，反應(yīng)底物中的辛酸相對過量，導(dǎo)致了催化劑的飽和效應(yīng)和底物抑制效應(yīng)，目標(biāo)產(chǎn)品含量不再增加[21]。綜合考慮，濃硫酸催化辛酸酸解椰子油反應(yīng)的底物物質(zhì)的量比選擇4∶1比較合適。

2.2.4 催化劑添加比例對產(chǎn)物中甘油三酯脂肪酸及sn-2位脂肪酸含量的影響

在反應(yīng)溫度90 ℃，反應(yīng)時(shí)間6 h，底物物質(zhì)的量比4∶1的條件下，考察催化劑的添加比例對試驗(yàn)的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 催化劑添加比例對產(chǎn)物中甘油三酯脂肪酸及sn-2位脂肪酸含量的影響

由圖4可知，隨著催化劑添加比例的增加，產(chǎn)物中辛酸、MCFA含量為先增加后平緩的趨勢，催化劑添加比例為3%時(shí)，產(chǎn)物中辛酸含量為28.80%，比原料油脂增加了23.34個(gè)百分點(diǎn)；MCFA含量為66.39%，相比椰子油增加了13.78個(gè)百分點(diǎn)；sn-2位辛酸含量為31.36%；sn-2位MCFA含量為74.95%，略低于椰子油中的76.53%；催化劑添加比例大于3%時(shí)，sn-2位辛酸含量增長幅度很小。當(dāng)催化劑添加比例由5%增加至6%時(shí)，產(chǎn)物中辛酸含量和MCFA含量反而有所下降。

隨著催化劑添加比例的增加，催化劑與底物分子接觸面積增大，促使目標(biāo)產(chǎn)物含量不斷增加，添加比例高于3%后，催化劑用量達(dá)到飽和，繼續(xù)添加催化劑對反應(yīng)影響不顯著；濃硫酸用量過多將會引發(fā)副產(chǎn)物增加，從而導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物含量下降，所以選擇催化劑添加比例為3%[22]。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果分析

根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以產(chǎn)物中MCFA含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)并進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表4中29組MCFA含量的響應(yīng)值進(jìn)行多次擬合回歸分析，得到MCFA含量的多項(xiàng)回歸方程，方差分析如表5所示。

MCFA含量/%=66.73+4.60A+0.85B+4.83C+5.26D-1.95AB-0.16AC-4.60AD+1.37BC+4.12BD+2.24CD+0.87A2-0.79B2-1.58C2+3.17D2。

由表5可知，回歸方程模型高度顯著(P<0.01)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，回歸方程的R2為0.906 5，說明該模型擬合較好，可用于預(yù)測產(chǎn)物中MCFA含量變化。對MCFA含量影響顯著因素的影響力由大到小依次為D、A、C、AD、D2、BD。

表5 MCFA含量的方差分析

注：P<0.01，差異高度顯著，用**表示；P<0.05，差異顯著，用*表示。

2.3.2 各因素交互作用對MCFA含量的影響

根據(jù)回歸方程結(jié)果，利用響應(yīng)面優(yōu)化得出各因素間交互作用的3D圖，反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和底物物質(zhì)的量比的交互作用對MCF含量的影響如圖5和圖6所示。

圖5 反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度的交互作用對MCFA含量的影響

圖6 底物物質(zhì)的量比和反應(yīng)溫度的交互作用對MCFA含量的影響

由圖5可知，反應(yīng)溫度為70 ℃時(shí)，隨反應(yīng)時(shí)間的延長，MCFA含量不斷增加；反應(yīng)溫度為110 ℃時(shí)，增長趨勢不明顯，這可能是由于高溫引發(fā)了更多的副反應(yīng)，導(dǎo)致酸解反應(yīng)中MCFA含量增長緩慢。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間較短(3 h)時(shí)，MCFA含量隨反應(yīng)溫度的增加而增加，而當(dāng)反應(yīng)時(shí)間較長(9 h)時(shí)，增長趨勢不太明顯，原因在于隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，反應(yīng)底物濃度不斷下降，從而導(dǎo)致反應(yīng)變緩。在不同的反應(yīng)溫度下，反應(yīng)時(shí)間的變化對MCFA含量的影響不相同，說明時(shí)間和溫度之間存在交互作用，兩者共同影響反應(yīng)中MCFA含量的增加。

由圖6可知，當(dāng)反應(yīng)溫度處于較低水平時(shí)，MCFA含量隨著底物物質(zhì)的量比的增大變化不大，這可能是因?yàn)樵谳^低溫度下，分子熱運(yùn)動(dòng)較慢，分子之間相互碰撞概率較小，所以不利于反應(yīng)的進(jìn)行；當(dāng)反應(yīng)溫度為110 ℃時(shí)，MCFA含量隨著底物物質(zhì)的量比的增加而增加。兩者交互作用顯著。

2.3.3 最優(yōu)工藝條件的確定與驗(yàn)證

由響應(yīng)面軟件得到的最佳工藝條件水平為反應(yīng)時(shí)間3.02 h，底物物質(zhì)的量比6.00∶1，催化劑添加比例5.00%，反應(yīng)溫度110.00 ℃，在此條件下所得產(chǎn)物中MCFA的理論預(yù)測含量為84.82%。

考慮到實(shí)際操作的可行性，修正工藝條件為反應(yīng)時(shí)間3 h，底物物質(zhì)的量比6∶1，催化劑添加比例5%，反應(yīng)溫度110 ℃，此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到的產(chǎn)品中MCFA含量為82.13%，與預(yù)測值接近，相比椰子油增加了29.52個(gè)百分點(diǎn)。此外，產(chǎn)品中辛酸和sn-2位辛酸含量分別為56.42%和43.17%，相比原料油分別增加了50.96個(gè)百分點(diǎn)和43.17個(gè)百分點(diǎn)，產(chǎn)品中sn-2位MCFA含量為76.17%，與椰子油相比無明顯變化。

2.4 產(chǎn)品中甘油三酯組成分析

由表6可知，產(chǎn)品中甘油三酯的當(dāng)量碳數(shù)在22～34之間。當(dāng)量碳數(shù)22～24的甘油三酯確定為MCT，含量總和為50.87%。而當(dāng)量碳數(shù)26～34的甘油三酯既可能為MCT,也可能是中長鏈甘油三酯，暫且不算作中鏈甘油三酯。因此可以確定產(chǎn)品中MCT的總含量至少為50.87%。

表6 產(chǎn)品甘油三酯組成及含量

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定了酸解椰子油制備富含MCT產(chǎn)品的最佳工藝條件：反應(yīng)時(shí)間3 h，底物物質(zhì)的量比6∶1，催化劑添加比例5%，反應(yīng)溫度110 ℃，在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的產(chǎn)品中MCFA含量為82.13%，與預(yù)測值接近，相比椰子油增加了29.52個(gè)百分點(diǎn)。此外，產(chǎn)品中辛酸和sn-2位辛酸含量分別為56.42%和43.17%，相比原料油分別增加了50.96個(gè)百分點(diǎn)和43.17個(gè)百分點(diǎn)，產(chǎn)品中sn-2位MCFA含量為76.17%，與椰子油相比無明顯變化。通過HPLC-ELSD測定最終產(chǎn)品中甘油三酯當(dāng)量碳數(shù)在22～34之間，其中MCT的總含量至少為50.87%。椰子油富含中鏈脂肪酸，是一種用于制備中鏈甘油三酯很好的原料。本研究為利用椰子油制備中鏈甘油三酯提供了理論依據(jù)，為中鏈甘油三酯的工業(yè)化生產(chǎn)及椰子油資源的深度開發(fā)利用提供了參考。