衛(wèi)向鋒，孫婷婷，張 紅△，牛春玲

（1. 西安中醫(yī)腦病醫(yī)院制劑科，陜西 西安 710032； 2. 陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003）

多動安顆粒為醫(yī)院制劑，由紫河車、熟地黃、石菖蒲、制遠志、澤瀉、黃連、生麻黃、佛手等11 味中藥組方，具有益腎填精、寧心安神、柔肝清火的功效，用于治療缺陷障礙（多動癥）之精虧肝亢證。多動安顆粒為醫(yī)院協(xié)定處方，臨床應用時間長，療效顯著，但藥味種類繁多且成分復雜，尚無其質量控制方法。本研究中采用薄層色譜（TLC）法對處方中主要起作用的4 味中藥黃連、佛手、熟地黃、麻黃進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法對處方中鹽酸小檗堿進行定量檢測?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：2010－AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司，包括UV 檢測器，LC－Solution 工作站）；UP3200H 型超聲波清洗器（熊貓集團南京電子計量有限公司，功率150 W，頻率40 kHz）；SQP 型電子天平（賽多利斯科學儀器＜北京＞有限公司，d＝0.1 mg）；JM－B 型電子天平（余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司，d＝1 mg）；XMTD－6000型電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；DFT－200A 型高速粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）。

試藥：對照藥材黃連（批號為120913－201310）、佛手（批號為120933－201004）、熟地黃（批號為121196－201105），對照品鹽酸小檗堿（批號為713－9404）、鹽酸麻黃堿（批號為0714－9903），購自中國食品藥品檢定研究院；多動安顆粒（醫(yī)院制劑，批號為190101，190102，190103）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

黃連：取本品6 g，研細，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液作為供試品溶液；另取黃連對照藥材0.25 g，同法制備對照藥材溶液；取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作為對照品溶液。按處方比例和制法制備缺黃連的陰性對照品溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 中薄層色譜法試驗，分別精密吸取供試品溶液、對照藥材溶液與陰性對照品溶液各3 μL，對照品溶液1 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素納為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯－異丙醇－甲醇－水－三乙胺（3 ∶3.5 ∶1 ∶1.5 ∶0.5 ∶1，V／ V／ V／ V／ V／ V）為展開劑，置用濃氨試液預飽和20 min 的展開缸內，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視[1]。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。結果見圖1 A。

佛手：取樣品12 g，研細，加甲醇40 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取佛手對照藥材1 g，同法制得對照藥材溶液。按處方比例依法制備陰性對照品溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 中薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液與陰性對照品溶液各5 μL、對照藥材溶液2 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素納為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以正己烷－乙酸乙酯（3 ∶1，V／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視[2]。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。結果見圖1 B。

熟地黃：取樣品33 g，研細，加水80 mL，煎煮30 min，用脫脂棉濾過，濾液用乙酸乙酯振搖提取3 次，每次50 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取熟地黃對照藥材4 g，同法制備對照藥材溶液。按處方比例依法制備缺熟地黃的陰性對照品溶液[3]。照2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 中薄層色譜法試驗，精密吸取供試品溶液、陰性對照品溶液與對照藥材溶液各5 μL，分別點于同一羧甲基纖維素納為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以二甲苯－乙酸乙酯（1 ∶1，V／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2，4－二硝基苯肼乙醇試液顯色。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。結果見圖1 C。

麻黃：取樣品100 g，研細，加濃氨試液適量，加三氯甲烷100 mL，超聲處理40 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取鹽酸麻黃堿對照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。按處方比例依法制備缺麻黃藥材陰性對照品溶液[4]。2015年版《中國藥典（四部）》通則中0502 薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液與陰性對照品溶液各25 μL、對照品溶液5 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以正丁醇－冰醋酸－水（8 ∶2 ∶1，V／ V／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。結果見圖1 D。

圖1 薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈－0.05 mol／L 磷酸二氫鉀溶液（50 ∶50，V／ V，每100 mL 中含十二烷基硫酸鈉0.4 g，pH ＝4.0）；檢測波長：345 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL／min；進樣量：10 μL。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計應不低于5 000[5]。

2.2.2 溶液制備

取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為22 μg／mL 的對照品溶液。

稱取本品約0.6 g，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇－鹽酸（100 ∶1，V／ V）25 mL，超聲處理30 min，補足減失的質量，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

按處方比例依法制備缺黃連的陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取上述3 種溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應保留時間處有相應色譜峰，而陰性對照無干擾。詳見圖2。

線性關系考察：分別精密吸取上述對照品溶液2，4，6，8，10，12 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，并以進樣量（X）為橫坐標，以峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y＝4E ＋06X－10 797，r＝0.999 9（n ＝6）。結果表明，鹽酸小檗堿進樣量在0.044 ～0.264 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

圖2 高效液相色譜圖

精密度試驗：取同一對照品溶液，精密吸取對照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣6 次。結果的RSD為0.061%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為190101）樣品適量，研細，約0.6 g，共6 份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇－鹽酸（100 ∶1，V／ V）25 mL，超聲提取30 min，補足減失的質量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按擬訂相色譜條件測定。結果平均含量為0.647mg／g，RSD為2.27%（n ＝6），表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為190101）樣品0.6 g，研細，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別在放置0，2，4，6，8，10 h 時測定。結果含量的RSD為0.085%（n ＝6），表明供試品溶液在10 h 內穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品共6 份，研細，每份約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按供試品與對照品比例1 ∶1 加入鹽酸小檗堿對照品溶液，再依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，計算加樣加收率。結果見表1。

表1 鹽酸小檗堿加樣回收試驗結果（n ＝6）

2.2.4 樣品含量測定

取3 批樣品（批號分別為190101，190102，190103），依法制備供試品溶液，各精密吸取10 μL，注入液相色譜儀。結果3 批樣品中鹽酸小檗堿含量分別為0.644，0.652，0.644 mg／g。

3 討論

3.1 薄層鑒別條件選擇

初期對處方中各藥材進行定性鑒別考察。2015年版《中國藥典》中暫未收載紫河車薄層色譜鑒別標準，故未將紫河車列入薄層色譜鑒別項。因本處方提取方法為水煎煮法，石菖蒲、制遠志及澤瀉藥材中成分大多為脂溶性成分，薄層色譜法不能鑒別其相應成分斑點，故最終選擇黃連、佛手、麻黃、熟地黃作為薄層鑒別項。本試驗中對麻黃藥材薄層展開劑進行選擇，分別比較了三氯甲烷－甲醇－濃氨試液（20 ∶5 ∶0.5，V／ V／ V）和丙酮－甲醇－濃氨試液（20 ∶5 ∶0.5，V／ V／ V）[6－7]。結果表明麻黃薄層鑒別中展開劑的極性應偏大，更換為正丁醇－冰醋酸－水（8 ∶2 ∶1，V／ V／ V），所得薄層色譜斑點集中，分離度良好。

3.2 含量測定指標選擇

指標選擇：初期根據處方中藥材的化學成分及藥理作用對含量測定指標進行選擇。由于遠志藥材中的遠志皂苷在制劑中質量不穩(wěn)定，澤瀉藥材中乙酰澤瀉醇B在水中溶解度低，故遠志和澤瀉中成分不適合作為該制劑的質控指標。熟地黃藥材和佛手藥材中有效成分含量較低，缺少對照品，故未將其作為質量控制指標。鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿為麻黃藥材中主要有效成分[8]，但由于該制劑中這2 種生物堿保留時間和含量均不穩(wěn)定，難以控制質量，故未將其作為質控指標。黃連中含生物堿類成分，具有清熱燥濕、瀉火解毒功效[9]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，黃連具有降血糖、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗心律失常等活性，其中鹽酸小檗堿為發(fā)揮藥效的主要有效成分[10]。黃連具有廣泛的藥理活性，用于諸多中藥制劑如黃連上清丸、一清膠囊、人參再造丸等中，故選擇黃連中鹽酸小檗堿含量作為該制劑的質量控制指標。

提取溶劑考察：取同一批（批號為190101）樣品適量，研細，分別加入甲醇、甲醇－鹽酸（100 ∶1，V／ V）、甲醇－鹽酸（100 ∶3，V／ V）和甲醇－鹽酸（100 ∶5，V／ V）25 mL，超聲處理30 min，用上述溶液補足減失的質量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液。按擬訂色譜條件測定鹽酸小檗堿含量結果分別為0.638 0，0.637 8，0.583 6 mg／g?？梢?，采用甲醇－鹽酸（100 ∶1，V／ V）比例的溶劑提取的鹽酸小檗堿含量最高，故選擇用甲醇－鹽酸（100 ∶1，V／ V）作為樣品提取溶劑。

提取時間考察：取同一批（批號為190101）樣品適量，精密加入甲醇－鹽酸（100 ∶1，V／ V）25 mL，分別超聲提取15，30，45 min，稱定質量，用甲醇－鹽酸（100 ∶1，V／ V）補足減失的質量，搖勻，取續(xù)濾液，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測得鹽酸小檗堿含量分別為0.571 2，0.668 0，0.667 3 mg／g?？梢姡曁崛?0 min 鹽酸小檗堿含量最高，故確定超聲提取時間為30 min。

3.3 方法評價

本研究中建立了多動安顆粒中黃連、佛手、麻黃、熟地黃的薄層色譜鑒別方法，對該制劑中鹽酸小檗堿含量進行測定，并對方法學進行了考察。該方法簡單，專屬性強、耐用性好，可用于多動安顆粒的質量控制。